實驗方法原理
蛋白質的α-氨基與丹磺酰氯(DNS-Cl 是一種熒光物質) 反應, 生成DNS-蛋白質, 經水解可生成DNS-氨基酸。通過聚酰胺薄膜層析分析DNS-氨基酸, 可確定蛋白質的N-末端氨基酸。此法靈敏度高, 也可用于蛋白質的氨基酸組成的測定。聚酰胺對極性物質的吸附作用是: 它能和被吸附物質間形成氫鍵, 這種氫鍵的強弱決定了被分離物與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時展層劑與被分離物在聚酰胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離物在聚酰胺表面發生吸附、解吸附、再吸附和再解吸附的連續過程, 就能導致分離物達到分離的目的。
實驗材料 蛋白質
試劑、試劑盒 氨基酸丙酮丹磺酰氯鹽酸碳酸氫鈉甲酸水苯冰醋酸乙酸乙酯甲醇冰乙酸磷酸三鈉乙醇三乙胺
儀器、耗材 真空干燥器水解管烘箱紫外分析燈玻璃試管聚酰胺薄膜
實驗步驟
1. 標準氨基酸的丹磺酰化
分別稱取2 . 3μmol 層析純的氨基酸, 溶于0 . 5 ml 0 . 2 mol/ L碳酸氫鈉溶液中。取0 . 1 ml 于有塞玻璃試管中, 加入0.1 ml DNS-Cl 丙酮溶液, 檢查pH, 必要時用三乙胺調pH9 . 0～ 9 . 5 ,于室溫(25 ℃ 左右) 下放置2～ 4 h。再用無離子水稀釋10 倍,貯存于暗處。經層析, 得DNS-氨基酸的標準圖譜。
2. 蛋白質N-末端氨基酸的DNS 化
取0 . 5 mg 蛋白質樣品, 置于有塞玻璃管中。用少量水溶解后, 加入0 . 5 ml 0 . 2 mol/ L 碳酸氫鈉溶液。再加入0 .5 mlDNS-Cl丙酮溶液, 用三乙胺調至pH9 . 0～9 . 5 , 塞好塞子, 于40 ℃ 烘箱中反應2 h , 或室溫(25 ℃左右)放置2～4 h , 生成DNS-蛋白質。
3. DNS-蛋白質的水解
DNS 化反應結束后, 真空蒸去丙酮, 加入0 . 5 ml 6 mol/ L 鹽酸溶解DNS-蛋白質。全部移入水解管, 抽真空封管, 于111 ℃烘箱中水解18～24 h。開管后蒸去鹽酸, 加少量水, 再蒸干。重復2～3 次以除盡鹽酸。
4. DNS-氨基酸的抽提
將上述水解產物, 加0 . 5 ml 水, 用1 mol/ L 鹽酸調至pH2～3。加入0 . 5 ml 乙酸乙酯抽提, 分層可在細長滴管中進行。重復抽提2～3 次, 將上層抽提液合并于小試管中, 抽去乙酸乙酯,置于干燥器中備用。
5. DNS-氨基酸的層析與檢測
生成的DNS-氨基酸和標準DNS-氨基酸分別進行聚酰胺薄膜層析。
（1）聚酰胺薄膜的準備
將聚酰胺薄膜剪成7 cm×7 cm 的方塊, 在距邊0 . 5 cm 處畫互為垂直的兩條基線, 交叉點為原點。若只做單相層析, 則只畫一條基線, 在基線上每隔1 cm 畫一點樣點。
（2）點樣
用毛細管取樣, 點在點樣位置上, 點樣直徑應小于2 mm。若多次點樣, 則點一次, 吹干一次。
（3）展開
將點好樣的聚酰胺薄膜卷成圓筒形, 樣品則在筒內, 箍以線圈固定。放在小層析槽內(可在小干燥器內置一培養皿代替) ,槽內( 培養皿) 放入5～10 ml 展開溶劑Ⅰ , 進行展開, 以溶劑前沿到達距頂端0 . 5 cm 左右為止( 約20 min )。取出膜片, 吹干。進行雙向層析時, 在第一向層析完畢, 完全吹干(有時需晾過夜, 才能充分吹干) , 將聚酰胺薄膜片轉90°, 用展開溶劑Ⅱ 展開。為了區分DNS-蘇氨酸或者區分DNS-天門冬氨酸與DNS-谷氨酸, 可在溶劑Ⅱ展開后, 吹干, 接著用溶劑Ⅲ沿同一個方向展開, 只需展開至一半高度即可。為了區別ε-DNS-賴氨酸、α-DNS-組氨酸與DNS-精氨酸, 應在溶劑Ⅱ 中展開后, 吹干, 接著在溶劑Ⅳ中沿同一個方向展開。
（4）DNS-氨基酸的檢測
展開結束后, 取出薄膜, 用電吹風機吹干, 在360 nm 或280 nm的紫外燈下檢測。DNS-氨基酸呈黃色熒光。此外還有其他顏色的雜點, 如DNS-OH 顯綠色熒光等。用樣品的層析譜與標準DNS-氨基酸層析譜相比較, 可鑒別樣品DNS-氨基酸的種類。