效價照紫外-可見分光光度法(通則0401)測定。胰蛋白酶溶液臨用新制,并置冰浴保存。
精密稱取結晶蛋白酶(每1mg含7500~10000BAEE單位)適量,用冷的氯化鈣鹽酸溶液(取氯化鈣2.94g,加0.001mol/L鹽酸溶液o00ml溶解)溶解并稀釋制成每1ml中約含0.1mg的溶液底物溶液臨用新制,并置暗處保存。取苯甲酰-精氨酸--對硝基苯胺鹽酸鹽適量,加水溶解并稀釋制成每1ml中含1mg的溶液。0.2mol/L三乙醇胺緩沖液(pH7.8)取三乙醇胺29.8g,加水900ml溶解,用4mol/L鹽酸溶液調節pH值至7.8,加水至1000ml供試品溶液精密量取本品適量,用0.2mol/L三乙醇胺緩沖液(pH7.8)定量稀釋制成每1ml中約含50單位的溶液。標準品溶液取烏司他丁標準品,加0.2mol/L三乙醇胺緩沖液(pH7.8)溶解并定量稀釋制成每1ml中約含50單位的溶液。
測定法取0.2mol/L三乙醇胺緩沖液(pH7.8)(預熱至25℃±1℃)1.6ml,置比色池中,加標準品溶液與胰蛋白酶溶液各0.2ml,混勻,準確保溫5分鐘,使比色池內溫度保持在25℃士1℃,加底物溶液(預熱至25℃±1℃)1.0ml,立即搖勻并計時,以水為空白,在405nm的波長處,每隔1分鐘測定吸光度,共5分鐘,吸光度的變化率應恒定。以反應時間為橫坐標,吸光度為縱坐標作圖,求出每1分鐘的吸光度變化率(△A,。分別取0.2mol/L三乙醇胺緩沖液(pH7.8)與供試品溶液各0.2ml,代替標準品溶液同法操作,求出吸光度變化率△A和△A2,按下式計算每1ml烏司他丁的效價(單位)△A。-△A:×UX式中△A。
為三乙醇胺緩沖液吸光度的變化率;△A1為供試品溶液吸光度的變化率;△A為標準品溶液吸光度的變化率;U為每1ml標準品溶液中含烏司他丁單位數;V為供試品取樣量,ml;n為供試品的稀釋倍數測得的效價應為估計效價的90%~110%,否則應調整供試品溶液的濃度重新測定。蛋白質含量精密量取本品適量,照蛋白質含量測定法(通則0731第一法)測定每1ml中蛋白質含量,即得。比活由測得的效價和蛋白質含量計算每1mg蛋白中含烏司他丁活力的單位數