九大測序平臺對比（四）

5.Helicos

企業: Helicos Biosciences

推出時間: 2008年

主流型號: HeliScope? Single Molecule Sequencer（2008年推出）

樣品要求: 1-3 μg，起始DNA體積不超過100 μL.

測序原理: 邊合成邊測序,可逆阻斷測序

待測DNA被隨機打斷成小片段，在每個小片段（~200 bp）的末端加上poly-dA，并于玻璃芯片上隨機固定多個poly-dT引物，其末端皆帶有熒光標記，以利于精確定位。首先，將小片段DNA模板與檢測芯片上的poly-dT引物進行雜交并精確定位，然后逐一加入熒光標記的末端終止子。這個終止子與Illumina的終止子可不一樣，不是四色的，是單色的，也就是說所有終止子都標有同一種染料。在摻入了單個熒光標記的核苷酸后，洗滌，單色成像，之后切開熒光染料和抑制基團，洗滌，加帽，允許下一個核苷酸的摻入。通過摻入、檢測和切除的反復循環，即可實時讀取大量序列。最后以軟件系統輔助，可分析出完整的核酸序列。

文庫制備: Fragment, Mate-pair

模板制備: 單分子檢測

讀長: 25-55 bp，平均35 bp

測序通量: 21 to 35 Gb/run

時間/run: 8 days

堿基精確度: >20X覆蓋度時一致性超過99.995%

變異檢測能力(DNA重測序方面): SNP, CNV

成本: 儀器$999,000/臺，測序$0.45-0.60/Megabase.

數據格式: Raw data：srf或者sms格式

分析軟件: 推薦用Helisphere開放資源軟件進行過濾比對

優點: 真正的單分子測序，無需前期擴增，不引入偏向性;特別適合RNA-Seq或RNA直接測序的應用，因為它能直接測序RNA模板，而無需將其轉化成cDNA。檢測堿基替換突變的誤差率非常低，~0.2%。

缺點: 錯誤率高，Insertion 1.5%，Deletion 3.0%；Heliscope在面對同聚物時也會遇到一些困難，但可以通過二次測序提高準確度；由于在合成中可能摻有未標記的堿基，因此其最主要的錯誤來源是缺失。

經典案例: 1.Single-molecule sequencing of an individual human genome.

Dmitry Pushkarev,Norma F Neff & Stephen R Quake.Nat Biotechnol, 27. (9): 847-852.

(更多詳見http://www.helicosbio.com/HeliSp ... id/169/Default.aspx)

備注: 特別適合RNA-Seq或RNA直接測序的應用

6.DNA Nanoball array

企業: Pacific Biosciences

推出時間: 2009年底Science論文發表,2010年推出

主流型號: DNA Nanoball array

樣品要求: DNA 由

PicoGreen定量：推薦10ug，最少7.5ug。濃度:75-150ng/ul;體積：50-200ul;DNA長度：大分子量雙鏈基因組DNA，大部分超過20kb.

測序原理: 邊連接邊測序

采用了高密度DNA（玻璃板）納米芯片技術和非連續、非連鎖聯合探針錨定連接（cPAL）技術來進行測序。基因組隨機打斷成500bp隨機長度的片段，兩端接上接頭，成環，限制性內切酶酶切，重復2次，最終連接成一個DNA環，現階段4接頭建庫方法能夠支持70bp單端測序（35bp雙端測序）。接著，所示，每個DNA環在反應液中高速擴增，形成一個納米球（DNB），這樣每一個DNA環大約擴增了200次。然后把這些納米球平鋪到預先處理過的玻璃板上，形成納米芯片。最后通過非連鎖聯合探針錨定連接（cPAL）技術進行測序，10bp長的探針上有一個錨定堿基（A or T or G or C），其他位置都是N，通過與模板的雜交連接反應，根據4種不同的堿基（A/T/G/C）會有四種不同的熒光信號，總共需要40種不同的錨定探針。每一種錨定探針雜交之后都會進行洗脫。通過DNB芯片的熒光顯影結果及解碼分析，我們可以確定每個DNB的核酸序列。

文庫制備: 500bp

模板制備: 納米球（DNB）

讀長: 35PE

測序通量: 20-60G/run/flow slide,共18 個flow slide

時間/run: 9 days

堿基精確度: 99.999%

變異檢測能力(DNA重測序方面): SNP、Indel、SV、CNV

成本: 只提供測序服務，不出售儀器。09年11月的WGS成本為$1726 （45×），$8005 （87×）

數據格式: 基礎文本格式，*.tsv。可交付結果包括：序列變異、功能注釋、數據總結報告 及一整套上述結果的支持數據。

數據由三部分組成，主要部分是reads和mappings，其次是assambly 和variations，summary report最少

分析軟件: Genome comparison tools、Format conversion tools、Annotation tools、Reference tools，在開發中的還有用于癌癥基因組分析的腫瘤-正常樣本比對工具和用于家族基因組分析的工具，還有大規模比對工具可以同時比對數百個基因組。Complete Genomics Assembly Pipeline version 1.5.0

優點: 測序自動化，成本低，通量大

缺點: 讀長短，分析軟件不公開，樣品要求高

經典案例: Identification by whole-genome resequencing of gene defect responsible for severe hypercholesterolemia. Jonathan Rios, et al. Human Molecular Genetics, Volume19, Issue22 Pp. 4313-4318.

Human Genome Sequencing Using Unchained Base Reads on Self-Assembling DNA Nanoarrays.Radoje Drmanac1,et al. Science, Vol. 327 no. 5961 pp. 78-81 .

Analysis of Genetic Inheritance in a Family Quartet by Whole-Genome Sequencing. Jared C. Roach,et al. Science, Vol. 328 no. 5978 pp. 636-639

The mutation spectrum revealed by paired genome sequences from a lung cancer patient.William Lee,et al.Nature ,Volume:465, Pages: 473–477

備注: mapping reads：40X/genome