乳腺上皮細胞培養

實驗方法原理 在內源性巨噬細胞存在的條件下，將經離心得到的哺乳早期的乳汁上皮細胞放入營養豐富的培養液中培養，并可用混合性蛋白酶螯合液傳代。

試劑、試劑盒 RPMI 1640胎牛血清人血清胰島素氫化可的松霍亂毒素胰蛋白酶液

儀器、耗材 培養瓶 離心管

實驗步驟

材料

無菌

1. 生長培養液：RPMI 1640

2. 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS)

3. 人血清（human serum: 血庫過期的血清，澳大利亞抗原陰性）

4. 儲存備用的液體：

(a) 1 mg/ml 胰島素（Sigma)：用 6 mmol/L 鹽酸配制；

(b ) 0.5 mg/ml 氫化可的松：用生理鹽水配制；

(c) 50ug/ml 霍亂毒素: 用生理鹽水配制。

注意事項

血清和儲存備用的胰島素、氫化可的松、霍亂毒素、胰酶和胰蛋白酶應在-20°C 條件下保存。

5. TEGPED： 胰蛋白酶液，含有下列成分

(a) 13 mmol/L EGTA (ethylene glycol-bis-(β-aminoethylether) -N，N，N‘，N'-tetraacetic acid，Sigma）：10 ml，用 D-PBSA 配制；

(b) 7 mmol/L EDTA（diaminoethane tetraacetic acid，Sigma): 4 ml, 用 D-PBSA 配制；

(c) 0.2% 胰蛋白酶（Difco,B-I) Bioscience): 4 ml, 用 HBSS 配制；

(d) 1% 胰蛋白酶（Difco ,B-D Bioscience): 2 ml，用 HBSS 配制。

6. 生長培養液：RPMI 1640, 添加 15% FBS、10% 人血清、50ng/ml 霍亂毒素

7. 0.5ug/ml 氧化可的松和 1ug/ml 胰島素 

8. 50 mm Nunc 塑料培養皿或 25 cm2 培養瓶 

9. 普通容器或 20～50 ml 離心管

操作步驟

最好在醫院病房于產后 2～7d 收集乳汁。用無菌水擦洗乳房，然后用手將乳汁擠入無菌容器。一般每個病人收集 5～20 ml 乳汁。將收集的乳汁混合后，用 RPMI 1640 稀釋（1 : 1 ) , 以利于離心。

原代培養 

1. 將稀釋的乳汁離心（600～1000 g，20 min) 后，輕輕吸去上清。為了避免影響沉淀細胞，應留有少量液體。

2. 用含有 5% FCS 的 RPMI 1640 清洗細胞 2～4 次，直至上清不渾濁。

3. 用生長培養液混懸細胞，將 5ul 細胞懸液加入 50 mm 培養皿（Nunc)。然后，加人 6 ml 生長培養液，在 37°C 和 5 % CO2 條件下培養細胞。

4.3～5d 后換培養液，以后每周換 2 次。6～8d 出現克隆，克隆細胞生長擠掉巨噬細胞。開始時，巨噬細胞起著飼養細胞的作用。

傳代培養

5. 在 37℃ 條件下用 TEGPED (每個 50 mm 培養皿 1.5 ml) 孵育細胞 5～15 min。孵育時間根據細胞已培養時間而定。然后，混懸細胞。

6. 離心（100 g，5 min ) 后，用 6 ml 培養液混懸細胞。

7. 將細胞懸液分放入 50 mm 培養皿和 25 cm2 培養瓶，每 3 個培養皿或每個培養瓶 2 ml。

8. 加入 4 ml 新鮮培養液，將細胞懸液稀釋 3 倍。