什么是高通量篩選技術？什么是高內涵藥物篩選？

【導讀】高通量篩選是指以分子或和細胞水平的實驗方法為基礎，采用不同密度的微孔平板作為實驗載體和自動化工具操作實驗步驟，通過快速靈敏的檢測裝置在同一時間內對海量樣品進行生物活性測定、采集實驗數據和數字化分析處理，并以相應的信息管理軟件支持整個系統正常運轉的技術體系。高內涵篩選是指在保持細胞結構和功能完整性的前提下，同時檢測被篩樣品對細胞形態、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉導各個環節的影響，在單一實驗中獲取大量相關信息，確定其生物活性和潛在毒性。

1、什么是高通量篩選技術？

高通量篩選（High- throughput screening, ，HTS）是指以分子或和細胞水平的實驗方法為基礎，采用不同密度的微孔平板作為實驗載體和自動化工具操作實驗步驟，通過快速靈敏的檢測裝置在同一時間內對海量樣品進行生物活性測定、采集實驗數據和數字化分析處理，并以相應的信息管理軟件支持整個系統正常運轉的技術體系。

2、傳統的藥物篩選模式是怎樣的？

傳統的藥物發現模式是在確定藥物作用靶點及其功能和/或結構的基礎上，采用各種實驗手段，通過體內外多種模型對樣品進行篩選，評價其生物活性和藥理特征。根據活性分子的特點，進行化合物結構的優化改造，經動物毒理和藥代動力學分析研究后確定藥物先導化合物,進入人體臨床試驗。這種方法一般需要消耗大量的樣品和實驗動物，對技術人員的操作技能有較高要求，難以在短時間內對一定數量的樣品開展有效和經濟的篩選。隨著各類化合物樣品庫儲量的不斷增加以及組合化學技術的應用，采用傳統手段篩選海量樣品不僅不可能而且極大地限制了新藥研究之進程。

3、高通量篩選技術與傳統的藥物篩選方法相比有什么優勢和局限？

高通量藥物篩選在傳統篩選手段的基礎上，綜合應用多種先進的技術成果和制造工藝，使藥物發現的方式方法和理論模式產生了巨大的變化。高通量藥物篩選技術以藥物與靶分子或靶細胞之間的作用機理為依據進行生物活性分析，通過整合計算機控制、自動化操作、平行多道檢測和數據采集處理等各個步驟，達到微量、快速、靈敏、準確的目標，是當代新藥發現技術的重大進步，為全球各大醫藥公司和著名研究機構所廣泛使用。

與傳統的藥物篩選方法相比，高通量篩選技術具有反應體積小，自動化，靈敏快速檢測，高度特異性等優點。但是，高通量篩選作為藥物篩選的方法，并不是一種萬能的手段，特別是在中藥研究方面，其局限性也是十分明顯的。

首先，高通量篩選所采用的主要是分子、細胞水平的體外實驗模型，因此任何模型都不可能充分反映藥物的全面藥理作用；

其次，用于高通量篩選的模型是有限的和不斷發展的，要建立反映機體全部生理機能或藥物對整個機體作用的理想模型，也是不現實的。但我們應該相信，隨著對高通量篩選研究的不斷深入，隨著對篩選模型的評價標準、新的藥物作用靶點的發現以及篩選模型的新穎性和實用性的統一，高通量篩選技術必將在未來的藥物研究中發揮越來越重要的作用。

4、高通量篩選由那幾部分組成？

高通量篩選由五個技術元件組成：

（1）化合物樣品庫

擁有足夠數量和結構各異的化合物樣品是實施高通量藥物篩選的基本條件之一。化合物樣品庫是由諸多具有不同屬性的有機化合物所組成的，包括人工合成、天然產物和微生物次生代謝物等多種來源。

（2）特異性體外篩選模型

高通量篩選不僅要求微升級的反應體積，而且要求這種反應具有靶點特異性和檢測敏感性，由此建立的篩選模型呈現出很高的技術含量。

（3）自動化操作系統

利用計算機通過操作軟件控制整個實驗過程。操作軟件采用實物圖像代表實驗用具，簡潔明了地以圖示體現機器的動作。自動化操作系統的工作能力取決于系統的組分，根據需要可配置加樣、沖洗、溫孵和離心等設備以進行相應的實驗步驟。

（4）高靈敏的檢測儀器

檢測儀器一般包括液閃計數器、化學發光檢測器、寬譜帶分光光度儀和熒光光度儀等。

（5）數據處理管理系統

數據處理管理系統主要承擔著化合物樣品及其生物活性信息的收集、存儲、分析、處理、整合和演繹的功能，為提供高通量藥物篩選服務和藥物發現與設計研究提供支撐。

5、化合物樣品庫是怎么建立的？

高通量篩選是一種利用已有的化合物進行的體外隨機篩選。因此，通過高通量篩選發現的苗頭化合物（Hit compounds）其有效性取決于被篩樣品庫的規模和質量。擁有足夠數量和結構各異的化合物樣品是實施高通量藥物篩選的基本條件之一。化合物的質量主要表現在樣品來源、組成種類、類藥性、理化特性和純度等方面。許多活性反應基團（Reactive groups）會使初篩的假陽性率大幅上升，將其剔除可以提高化合物樣品庫的質量。

化合物樣品庫是由諸多具有不同屬性的有機化合物所組成的，包括人工合成、天然產物和微生物次生代謝物等多種來源。

（1）人工合成又可分為常規化學合成和組合化學合成兩種方法。采用常規化學合成的純化合物一直是國外制藥企業化合物庫樣品的主要來源。它們通過長年累積的化合物建立樣品庫，通過購買和化合物交流使樣品庫的數量和質量不斷提高。

組合化學（Combinatorial chemistry）的出現為大量增加化合物的數量提供一條有效途徑。組合化學所要解決的根本問題是怎樣快速地得到大量結構多樣、覆蓋面廣的化合物樣品。它要求組合有限的幾種化學試劑以獲得盡可能多的產物。因此，同一組試劑應具有相同的反應基團，彼此之間的差別僅在于不參與合成反應的其他基團的不同。一步反應所得到的多種產物，實質上是同一類型結構略異的相似物；多步反應所得到的產物依然是同類型的，只是部分分子結構更多樣、更復雜而已。然而，當不同的共性反應不是按先后順序而是平行獨立進行時，就能夠獲得類型不同、結構各異的多種產物。

目前常用的組合化學合成方法包括固相和液相兩大類。固相合成即先把反應物連接到一個固相載體（通常是官能團化的高分子材料）上，然后在非均相的條件下進行有機反應，被廣泛應用于大數目樣品庫的合成。液相合成采用一步多組分或一鍋多步反應的經典技術，包括多組分合成法和官能團轉換法，核心問題在于反應產物的高效分離提純。多組分反應速度快、易操作，適用于合成數量大和多樣化的化合物樣品庫。官能團轉化法靈活方便，尤宜于數目較小的系列化合物樣品庫的制備，常用來進行結構修飾改造和構效關系研究。

（2）從天然產物里分離獲得的單體化合物，其母核結構和活性基團是通過長期的自然選擇而形成的，在篩選過程中所表現出來的生物活性具有人工合成化合物所無法比擬的優勢。因此，結構多樣的天然產物及其衍生物在創新藥物的研究中具有極其重要的地位。長期以來，天然藥物研究所采取的技術路線主要是以體內外藥理活性跟蹤檢測為基礎，從來源于陸地或海洋的動植物和微生物中提取、分離和鑒定有效成分，必要時進行結構修飾改造，最終確定藥物先導化合物。在一般情況下，通過全合成、半合成或直接提取的方式能夠解決原料之來源。為了加快新藥發現的進程和提高研究效率，近年來科研人員創建了一系列新技術、新方法和新手段，如自動化平行和序列組合高通量制備和色譜—波譜聯用高通量結構鑒定等，與高通量活性篩選技術相匹配，為快速測定各種天然產物樣品在不同靶點上的作用特性創造了條件，可在短時間內獲取大量的結構和活性信息。

6、藥物篩選常用的靶標有哪些種類？

現代藥物研究開發的關鍵步驟是發現、確定和應用藥物作用的靶分子，即藥物在體內發揮療效的作用位點，包括基因、酶、受體、離子通道和核酸等生物大分子，其中酶和受體的用途最廣。

（1）酶靶標

設為藥靶的酶一般在疾病進程中與病理性代謝途徑、信號轉導、蛋白加工或免疫反應等密切相關。酶的小分子抑制劑如抗腫瘤藥物氨甲蝶呤（二氫葉酸還原酶抑制劑）和5－氟尿嘧啶（尿嘧啶還原酶抑制劑）以及抗病毒藥物阿昔洛韋（逆轉錄酶抑制劑）等在臨床上已經廣泛應用。也有將關鍵酶的上游調節機制或把酶本身作為藥物的實例（如溶栓酶）。

基于酶動力學的篩選方法操作簡易，靈敏度高，適于高通量和自動化。由于大部分反應都是在均相狀態下進行，可明顯減少實驗誤差，也無需繁瑣的實時組織或細胞培養，從而提高了系統的穩定性。然而，無論是天然或重組的酶蛋白在分離純化過程中都可因丟失某些關鍵成分或輔因子，或者摻入一些雜質而影響酶的活性。其次，在人工條件下的檢測結果無法全面反映體內多種復雜的調控和反饋機制。再次，很多作為藥靶的酶是與細胞膜相結合的，不易分離或分離后難以保證其生物活性。至于由多亞基組成的酶，如何在分離純化后保持原有活性仍然是一個技術難題。因此，在建模時必須對特定酶的生物學特性（如生理效應、偶聯反應、表達位點、組織分布、胞內定位、前體蛋白和同工酶等）、物理化學特性（如溶解性、分子量、等電點及穩定性等）和反應條件（離子濃度、pH值和純度要求等）有比較詳盡的了解。

（2）受體靶標

受體包括膜受體和核受體兩類，占所有藥物作用靶點的60%以上。膜受體的種類繁多，包括G蛋白偶聯受體、配體門控離子通道、電壓門控離子通道、酪氨酸激酶受體等。G蛋白偶聯受體（G-protein coupled receptors，GPCR）是目前已知藥靶中最重要的一類，約40%的市售處方藥以其為靶點。迄今發現的1000多種G蛋白偶聯受體盡管功能復雜多樣，但結構卻非常保守，其特點為7個跨膜的α雙螺旋結構，其中N-端在胞外，C-端在胞內，通過相似的分子機制發揮生理作用，天然配體包括氨基酸、多肽、蛋白、脂肪酸和氣味分子等。

核受體是目前所知最大的真核轉錄調節因子超家族，通過與特異性配體作用調節靶基因的表達水平。根據配體的化學性質，核受體可分為三類：（1）類固醇激素受體；（2）非類固醇激素受體；（3）至今尚未發現其天然配體的孤兒型受體。核受體發揮生理功能的經典途徑是與細胞核內的DNA結合后激活或抑制靶基因轉錄，調節蛋白合成水平，引起相應反應。機體的生長發育、細胞分化和代謝凋亡等諸多生命過程都與核受體的作用密切相關，是一類重要的藥物靶點。
受體結合試驗發現的陽性化合物必須經過在活細胞內進行的功能檢測才能確定其藥理學特征，即激動劑、半激動劑、拮抗劑或半拮抗劑。對G蛋白偶聯受體而言，可以測定細胞信號轉導通路中信使或效應分子（如腺苷酸環化酶、磷脂酶C和蛋白激酶C等）的活性或三磷酸肌醇及鈣離子濃度來間接反映受體的功能狀態。由于核受體的信號途徑非常復雜，精確定量其靶基因的活化水平十分困難，采用報告基因表達系統則能克服這一技術屏障。在某些缺少內源性受體及其下游信號通路必要組成的細胞中，通過共轉染方法引入受體及含有受配體應答元件調控的報告基因，即可模擬受體的激活過程。根據報告基因轉錄和表達后所產生報告分子（如綠色熒光蛋白或熒光素酶等）的水平來判斷被測樣品的活性。在實驗體系中轉入監測質粒就能夠用于區分細胞毒性和拮抗效應的差別。

7、常用的高通量篩選模型有哪些？

篩選模型是指用于檢測藥物作用的實驗方法。由于高通量篩選要求反應總體積小、特異性強和敏感性高，因此對于篩選模型也有較高的技術標準。常用的篩選模型都在分子水平或細胞水平觀察藥物與靶點的相互作用，能夠直接認識藥物效應的基本機制。目前這些模型主要集中在受體、酶、通道以及各種細胞反應方面。近年也出現了基因水平的藥物篩選模型，使模型種類和涵蓋范圍更為廣泛。

（1）分子水平的藥物篩選模型：

① 受體篩選模型：指檢測受體與放射性配體結合的模型。以受體為作用靶點的篩選方法包括測定功能反應、第二信使生成和標記配體與受體相互作用等不同類型。

② 酶篩選模型：觀察藥物對酶活性的影響。根據酶的特點，底物和產物都可以作為檢測指標，并由此確定反應速度。典型的酶篩選包括（a）適當緩沖液中孵化；（b）控制反應速度，如：溫度、緩沖液的pH值和酶的濃度等；（c）測量產物的增加和底物的減少。

③ 離子通道篩選模型：舉例為（a）貝類動物毒素高通量篩選的作用靶為Na+通道上的蛤蚌毒素結合位點，用放射性配體進行競爭結合來考察受試樣品的活性特征；（b）用酵母雙雜交的方法來高通量篩選能干擾N型鈣通道β3亞單位與α1β亞單位相互作用的小分子，尋找新型鈣通道拮抗劑。

（2）細胞水平的藥物篩選模型：

主要觀察被篩樣品對細胞的作用，但不能反映藥物作用的具體途徑和靶標，僅反映藥物對細胞生長等生理過程的綜合作用，包括細胞激活、凋亡、增殖、轉錄調控、信號轉導、蛋白分泌和離子流動等。

8、高通量篩選技術采用那些檢測方法？

在液體移取、檢測儀器、數據處理和高密度微孔板應用取得巨大進展的同時，檢測技術的進步乃是提高篩選效率和命中率，使篩選系統完全自動化的重要環節。均相篩選技術主要應用于體外生物化學的檢測，其靶點包括特定的酶、受體或離子通道，具有快速、價廉、重現性好等優點。傳統的篩選技術，如受體配體結合、酶和細胞水平的篩選均為多步驟方法，通常會涉及到過濾、沉淀或吸收以及數次洗滌過程以分離結合與游離的配體或底物與產物。如曾經非常流行的ELISA方法，包括幾次孵育和洗滌步驟，勞動密集度高，即使優化后，日篩選最大通量仍然小于5000樣次。而那些使用同位素標記底物或配體的檢測方法，則會產生大量的放射性廢物。另外，這些實驗技術均不能完全適用于自動化操作，檢測過程中每增加一步都會延長完成實驗的時間，降低信號，減少通量。而高通量均相篩選技術卻能彌補這些缺陷，日篩量可達一萬樣次以上，對于建立高效快速的篩選體系至關重要。

國際上近些年來發展了許多基于熒光、化學發光或放射性活性檢測的新技術。而更為新興的納米技術，包括生物芯片及"量子球"（Quantum dots），使更高密集度形式的超高通量篩選成為可能。目前，基于熒光檢測技術的高通量篩選方法包括：熒光強度檢測、熒光偏振檢測、熒光共振能傳遞檢測、均相時間依賴熒光檢測或均相時間依賴熒光共振能傳遞檢測、共聚焦熒光顯微鏡、熒光成像分析和熒光報告基因檢測等。基于化學發光檢測技術的高通量篩選方法包括：電化學發光檢測、熒光素酶報告基因檢測及Alpha篩選檢測等。基于放射性活性檢測技術的高通量篩選方法包括：近親閃爍檢測方法、FlashPlate閃爍檢測方法和LEADseeker均相成像檢測等。另外還有表面膜共振檢測、液相色譜?質譜聯用檢測和毛細管電泳?質譜聯用檢測等先進的技術手段。

細胞分析技術能夠精確模擬活細胞的內環境，可用來驗證化合物樣品對細胞功能的影響，如增殖分化、信號轉導和轉錄翻譯等。常用的手段有放射性標記摻入法、四唑鹽還原法、Alamar Blue實驗、BrdU摻入法以及用于區別細胞毒性和增殖能力的熒光氧氣探測技術等。

9、高通量篩選數據庫有哪些功能？

高通量藥物篩選的特點是對數以萬計的化合物樣品進行隨機和平行的活性檢測，產生海量的原始數據，需要應用高效的數據庫管理系統進行收集、存儲、處理、分析、整合和演繹，其主要功能如下：

（1）樣品信息的存儲功能

數據庫具有對用于高通量篩選的化合物樣品進行存儲管理的功能。處理一般信息如理化性質、純度、來源、存量、位置等外，對每一個新入庫的化合物都要事先進行新穎性分析，排除結構相同的化合物，避免重復篩選。由于高度反應性基團增加了假陽性出現的機率，在必要時還需對新入庫的化合物進行反應基因檢測。此外，數據庫也保存對樣品采取質量控制和質量保障措施的記錄。

（2）活性信息的管理功能

數據庫完整記錄對庫存每個化合物進行不同模型篩選獲得實驗結果，科研人員可以采用多種分析軟件依此對其生物活性作出綜合評價。

（3）藥物篩選的服務功能

高通量藥物篩選的工作量大，自動化程度高，也涉及到許多后繼結果分析通報等繁瑣程序。數據庫管理系統能夠對與藥物篩選相關的業務往來通訊、檔案管理以及各種樣品標簽的打印進行綜合管理，使對外篩選服務各個環節有序化、標準化和流水化。

（4）藥物發現的研究功能

高通量藥物篩選產生大量的生物活性信息，數據庫管理系統利用這些信息，通過對在同一模型上呈現陽性反應的化合物進行結構分析來判斷是否存在初步的構效關系，或多種陽性結構是否存在一般規律，從而為后繼研究提供參考。

10、自動化操作系統是怎么工作的？

高通量藥物篩選在短時內要對數以萬計的化臺物樣品進行活性檢測，內容枯燥、步驟重復，人工操作容易因疲勞而出錯。自動化操作系統采用微孔板作為反應容器，具有固定的分布模式（Format），不同的微孔板通過條形碼加以標記。自動化操作系統通過光電閱讀器對特定微孔板上的特定位置進行操作，并將實驗結果及相關數據存貯在計算機內，從而使篩選過程快速有序，平行可控，易于重現，結果準確。

自動化操作系統利用計算機通過操作軟件控制整個實驗過程。操作軟件采用實物圖像代表實驗用具，簡潔明了地以圖示顯現機器的動作。科研人員可以自行編程，過程簡單，便于操作。自動化操作系統的工作能力取決于系統的組成都分，根據需要可配置加樣、沖洗、溫孵和離心等設備以進行相應的步驟。

除了實驗步驟的需要以外，自動化的加樣方式是決定篩選速度的重要因素。目前主要有單孔、8孔、96孔和384孔等幾種低中密度微孔板。單孔板一般用于對照樣品以及復篩中零散樣品的轉移。96孔和384孔板在酶活性檢測和需要同時開始與終止反應的篩選模型中是必需的。

自動化操作系統的另一個重要組成部分是堆棧（Hotel）。所謂堆棧是指在操作過程中用來放置樣品板、反應板以及對它們進行轉移所需的騰挪空間。因此，高通量篩選的樣品數量取決于堆棧的容量。

我們都知道，生藥的化學成分相當復雜，通過提取得到的提取物往往是大量單體組成的混合物，所以篩選前需要對生藥的提取物進行適當的分離。在眾多的分離手段中，制備型HPLC應該是最為理想的，它具有快速、高效、自動化等諸多優點。

由此可見，高通量藥物篩選的自動化操作系統由計算機及其操作軟件、自動化加樣、沖洗、溫孵和離心等設備以及堆棧這4個部分組成。不同的單位可根據模型類型和篩選規模選購不同的組分整合成為一個完整的操作系統。

11、高通量篩選系統的評價標準是什么？

對高通量篩選系統的正確評價可以判斷整個藥物篩選實驗的質量和由此所獲得結果之可靠性，主要指標包括可行性、穩定性、靈敏性和特異性，并引進了一些電子工程學的專業術語，如信號本底比（S/B）和信噪比（S/N）等。信號本底比反映實驗中信號平均值與本底平均值之間的差距。一般來講，S/B值越大，信號與本底的差距就越大，篩選模型對被測樣品的區分度越大。在高通量篩選中一般要求S/B值大于3。信噪比是儀器分析中常用的評價參數。噪音系指在同樣的條件下，本底所產生的記錄信號。一般要求高通量篩選實驗的S/N值大于10。

Z’因子巧妙地把信號的動態變化區間和信號變異性相結合，進行綜合統計分析，彌補了單獨使用信號本底比或信噪比的不足，因而被廣泛接受，成為評價高通量藥物篩選質量的最重要指標。Z’因子與S/B值和CV（變異系數）都有直接而密切的關系并以下式表示： 

Z’因子假定信號值和本底值的總體呈正態分布，而變異是由隨機誤差引起的，因而它能夠反應信號值和本底值總體的分布。Z’因子是一個無綱量參數，它的絕對值從1～0。如果信號值總體與本底值總體重疊，Z’＝0。一般要求Z’因子大于0.4，即S/B＝3、CV＝10%，達到這一標準的高通量藥物篩選實驗結果才可接受。

在初建篩選模型時，必須根據實驗產生的相關數據計算陽性對照物的EC50值或IC50值，與文獻報道值進行比較可以基本判斷模型的可行性。計算值與報道值在一定范圍（一到兩個數量級）內的差異對篩選結果的評估影響不大。

12、什么是高內涵藥物篩選？

雖然由高通量獲得的實驗結果較為準確，易于評價，但其檢測模型均建立在單個藥物作用靶分子的基礎上，無法全面反映被篩樣品的生物活性特征，如化合物對細胞產生的多種特異效應包括毒性作用。顯微熒光標記、數碼影像分析以及圖像數據處理技術的快速發展，使以高通量方式對細胞的多個生理環節進行檢測成為可能，有力地推動了藥物篩選技術由高通量篩選向高內涵篩選（High content screening, HCS）發展的革命性轉變。高內涵篩選是指在保持細胞結構和功能完整性的前提下，同時檢測被篩樣品對細胞形態、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉導各個環節的影響，在單一實驗中獲取大量相關信息，確定其生物活性和潛在毒性。從技術層面而言，高內涵篩選是一種應用高分辨率的熒光數碼影像系統，在細胞水平上檢測多個指標的多元化、功能性篩選技術，旨在獲得被篩樣品對細胞產生的多維立體和實時快速的生物效應信息。高內涵篩選技術的檢測范圍包括：靶點激活、細胞凋亡、分裂指數、蛋白轉位、細胞活力、細胞遷移、受體內化、細胞毒性、細胞周期和信號轉導等。

業界人士認為，高內涵篩選不僅能闡明被篩樣品與藥靶的相互作用關系，而且可同時了解細胞的其他生物學改變，進而研究其對相關代謝途徑的影響，并通過觀察細胞形態來預測化合物的毒性。應用高內涵篩選技術能夠加速發現具有潛在開發前景的活性化合物，設定深入評價的優先次序，為構效關系研究和結構優化改造提供有力的支持。因此，高內涵篩選代表著創新藥物研究技術發展的必然趨勢。

13、要進行高內涵藥物篩選需要什么基本設備？

開發高內涵篩選技術的最初目的是對樣品在細胞水平進行功能性檢測。美國Cellomics公司研制的ArrayScan HCS Reader是第一臺專用于高內涵篩選的儀器，既可以單獨使用，也能夠與其他自動化設備聯用。目前已有相當數目的儀器生產廠商開始研制這類儀器。制造商一般采用白色連續光源（或比較昂貴的激光光源）、多通道濾光片（適于常用的熒光染料）和CCD照相機分析固定細胞。對于活細胞的動態分析而言，白色連續光源因對染料的淬滅作用小和對細胞的光毒性低比激光更具優勢，且可以長時間記錄，適合于動力學研究。目前，高內涵篩選技術的應用已經從功能鑒定逐漸拓展到靶點發現、靶點驗證、活性初篩、代謝及毒理等研究領域，顯示了巨大的發展潛力。

圖像采集、圖像分析和數據儲存是高內涵藥物篩選設備的主要組成部分。其中用于圖像分析的"生物應用軟件"（BioApplications）大致可以分為兩種：一種是針對某類特定生物學反應而設計的，研究人員能夠在一定程度上通過修改參數來適應檢測精度的需要；另一種為通用模板，使用者可以根據不同參數的自由組合來設計自己的應用軟件。

實施高通量的高內涵分析在單位時間里會產生和采集數以萬計的圖像，必須及時處理和妥善保存。一個完整的高內涵篩選技術系統應該包括具有一定開放性的數據存儲庫，對不同來源的實驗數據進行統一的分析和管理，同時允許研究人員從其他計算機終端調取信息，分析研究。

14、可否例舉幾個高內涵藥物篩選的應用實例？

（1）受體功能檢測

G蛋白偶聯受體是最大的細胞表面受體家族，目前雖有200余個已經找到相應配體，但在人類基因組編碼超過1000個的G蛋白偶聯受體中仍有相當的數量不明其功能或配體，即孤兒型受體，為藥物靶點研究領域的熱點。這類受體的功能性研究大多基于胞內鈣流測定、報告基因表達或受體內化檢測。激動劑與受體結合引起后者構象改變而激活G蛋白，由此進一步調節下游分子靶標（如核苷環化酶、磷脂酶和激酶等）的活性，通過不同蛋白激酶級聯反應催化受體磷酸化，與β-arrestins結合，發生G蛋白解聚，最終出現受體內吞。

多種自發性熒光蛋白的應用使得以細胞成像技術開展配體研究成為可能。在確立大多數G蛋白偶聯受體被激動后從細胞表面內吞進入胞內這一普遍現象后多年，科學家才利用在β-腎上腺素受體C末段連接綠色熒光蛋白（GFP）的方式直觀地記錄了整個過程。研究表明，在受體C-末端連接熒光多肽不會干擾配體的結合，因而此技術可用于構建各種工程細胞株為篩選服務。Hirasawa等人曾經報告了利用GFP標記的受體以內吞為指標篩選孤兒受體GPR120配體的研究，發現不飽和長鏈脂肪酸可以激活該受體并刺激腸道分泌胰高血糖素樣肽－1，最終導致胰島素的分泌。β-arrestin與G蛋白偶聯受體的相互作用對籠形蛋白（Clathrin）介導的受體內吞是非常關鍵的，這一作用能被以GFP標記的β-arrestin可視化。只有高親和作用型的G蛋白偶聯受體才能與β-arrestin同時內吞，GFP在細胞內重新分布，形成易于分辨和計數的點狀小體，供研究者定量分析。

此外，也有人運用對pH 敏感的染料來監測G蛋白偶聯受體的活性。CypHer-5是一種對酸度敏感的花青素（Cyanine）染料衍生物，pK 值為6.1，在酸性環境下可以檢測到其產生的熒光。如果在受體的N-末端進行表位附加（Epitope tagging），選擇標記CypHer-5的抗體進行染色，只是在受體激活后發生內吞進入酸性的內體（Endosome）時染料才會發出紅色熒光并被檢測到。實踐表明，這種方法對Gs、Gi和Gq等結合的受體都適用，信號干擾少，可與綠色熒光蛋白標記平行使用。

（2）細胞毒性研究

早期、快速和體外毒性評價是提高藥物發現效率和準確度之關鍵所在。當前已經實現高通量化的細胞毒性檢測技術主要分為兩類：一是基于線粒體活性的方法，如MTT法、Alamar Blue法和ATP生物發光法等；其次是基于細胞膜通透性的熒光染色法，如Propidium iodide等。隨著對細胞凋亡通路的不斷認識，上述僅僅判斷細胞死亡而無法區分凋亡與壞死差別的細胞毒性檢測方法已不能滿足科研人員的需要了。

細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡，通過一系列嚴密調控的信號轉導來實現，是機體主動、有序清除過剩或衰老細胞的生理機制。細胞凋亡早期會有磷脂酰絲氨酸外翻、細胞內氧化還原狀態改變和線粒體膜電位變化等反應，在晚期則出現細胞膜通透性增加、細胞核裂解為碎塊產生凋亡小體等現象。而細胞壞死是一個被動的、因損傷而引起的細胞解體、釋放內容物之過程，往往伴隨炎癥反應等病理機制。熒光顯微鏡或流式細胞儀配合適當的熒光染料是區分凋亡或壞死最常用的手段。

高內涵篩選方法使實現熒光染色檢測細胞凋亡高通量化成為可能。Vogt等人以3種熒光染料分別標記細胞核、線粒體和微管，應用ArrayScan?對圖像進行自動采集和分析，根據細胞密度、核形狀、線粒體聚集狀況以及微管形態變化等指標系統地分析了兩個抗腫瘤藥物（平陽霉素和紫杉醇）的毒性及其作用機理，體現了明顯的技術優勢。L?vborg及其同事也利用類似的辦法評估了一種新型細胞毒藥物（CHS828）的毒理學特性，結果滿意。利用特定的生物應用程序（如Cell Health Profiling BioApplication）可以通過對不同檢測指標展開組合旨在分析凋亡進程。

（3）信號通路分析

細胞信號轉導通路本身和相互之間的交流調控方式極其復雜，傳統的實驗方法（如Western blot、凝膠遷移滯后檢測和報告基因表達系統）繁瑣耗時，無法研究單細胞反應。由于轉錄因子的核位移能以免疫熒光標記方法可視化，高內涵篩選技術使信號轉導途徑的高通量化研究成為可能。NF-?B通路在炎癥的發生和發展中起著非常重要的作用。IL-1和TNF?等許多細胞因子都是通過激活NF-?B通路來調節炎癥反應的。Ding等人在1998年成功運用ArrayScan?定量分析了由IL-1和TNF?誘導的NF-?B核位移。國家新藥篩選中心的科研人員最近利用同樣的方法確定了傳統中草藥瑞香狼毒的主要成分－異狼毒素的生物效應是由NF-?B通路所介導的。

MAPKs通路是另一條涉及多種功能的信號轉導途徑，在抗腫瘤藥物的篩選研究中尤為重要。ERKs是MAPKs的一個亞家族，活化后參與許多細胞內的反應，包括磷酸化重要的胞漿或膜蛋白、自身核轉位、磷酸化核內轉錄因子進而引起細胞分裂或分化。由于MAPKs能被多種受體激活，轉導多條信號通路，其功能必須受到嚴密的控制。高內涵篩選技術為能針對性地研究特定受體與某種MAPKs之間的關系提供了便利。例如，Ghosh等科研人員使用紅色熒光標記的EGF刺激細胞而啟動內吞，熒光標記配體與EGF受體結合后激活ERK信號轉導通路造成ERK的磷酸化和核轉位，兩個反應在同一細胞內被同時檢測量化并進行相關性研究，極大地提高了實驗效率和降低了成本耗費。

（4）細胞形態觀測

細胞的生理或病理反應往往會導致細胞形態的改變，如細胞器、大分子簇或細胞骨架在細胞內的位移；整個細胞形態或面積改變如神經細胞分化；細胞間距改變；細胞群落的形狀、大小和其中每個細胞位置的變化等。這些變化有的是與正常的生理過程相關的，如受體內化、信號轉導、遷移運動、有絲分裂和細胞分化等，而另一些則是受到外來刺激（包括化合物）后產生的：既可能同時發生，也可能以級聯反應的形式出現。高內涵篩選技術自動定量和統計分析細胞形態變化的功能為高信息量地開展細胞生物學研究提供了強大的武器。Ghosh和Haskins報道了一個能自動對熒光標記細胞進行形態區分和定量分析的生物應用軟件（Morphology Explorer BioApplication），使用者可從3個層面來研究細胞的形態改變：①全細胞形態；②亞細胞形態；③多細胞或細胞間形態改變。其中全細胞形態檢測包括了形狀、大小、突起的數量、長短和方向；亞細胞形態檢測包括了細胞內顆粒或纖維的位置、數量和走向等；多細胞檢測包括了細胞群落或多核細胞的外形、各細胞或核的分布情況等。化合物刺激或培養條件的改變有可能導致細胞骨架重新排列，從而使得細胞整體形態發生改變或者引起細胞之間距離或位置的變化。高內涵技術手段不僅可以快速記錄這些形態變化，而且能夠有效分析單一或混合培養細胞的群落形成、細胞鋪展、胞內顆粒以及神經突觸等現象，使篩選信息在多種層次上得以采集演繹。

（5）動態分析檢測

早期活細胞功能檢測所使用的染料大多是有機小分子，旨在測定細胞內金屬離子濃度（如Ca2+等）、膜電位變化、細胞器定位和功能（如線粒體電位改變）等。隨著熒光檢測技術的不斷成熟和在細胞生物學研究中的廣泛應用，熒光標記開始向大分子方向發展。運用綠色熒光蛋白及其變異體使許多生物大分子的表達、分布、活化和位移過程可視直觀。最近又有人把一類穩定性高、易于修飾、可發熒光的過渡金屬硫化物應用到生物學的實驗研究中，即"量子球"技術，其應用前景無限廣闊。自動熒光顯微技術和先進熒光試劑的產生使活細胞的動態可視研究進入了一個嶄新的時代。

雖然上述高內涵實驗技術經過短短數年的發展已經逐步整合到高通量藥物篩選的實踐中，但它仍然處在早期階段，在儀器制造、圖像處理和運轉速效等方面都有待于進一步的提高。標記分子、常用試劑的開發也必須超越GFP和現有的熒光染料，以便開展更多的活細胞實時檢測。最后，包括機器、試劑、耗材和軟件在內的市售價格之實質性降低必將促進這項先進技術的推廣與普及。