從豌豆組織分離葉綠體實驗

葉子組織

PBF-Percoll 溶液 山梨醇 BSA HEPES-KOH EDTA

聚碳酸酯離心管

1. 制備 Percoll 梯度

(1) 兩個 50 ml 的聚碳酸酯離心管中分別加入 25 ml 50% 的 PBF-Percoll 溶液。

50% PBF-Percoll

0.33 mol/L 山梨醇

50 mmol/L HEPES-KOH，pH 8.0

2 mmol/L EDTA

1 mmol/L MgCl₂

1 mmol/L MnCI₂

50% Percoll (v/v)

3% PEG 6000 (w/v)

1% BSA ( 無脂肪酸，比如 Sigma 的 A7030）

1% Ficoll (w/v)   

(2) 29000 g（15600 r/min，SS34 轉頭；Sorvall）離心 15 分鐘形成 Pencoll 梯度。

形成的梯度可放 4℃ 過夜。

2. 組織勻漿

(1) 用剪刀收獲葉子組織（照上述方法培養，一個平盤可得到大約 100 g 的葉組織），切成碎片，移至 1 L 的塑料燒杯中。

(2) 加入冰冷的研磨懸浮緩沖液。在 4℃ 房間內，用 Polytron 勻漿器（帶有 PTA-36/2 mol/L 發生器的 PTA 10/35 型）研磨葉子，每兩到三個 5 秒脈沖為一循環，進行 6~7 次循環。

研磨懸浮（GR）緩沖液：

2 mmol/L EDTA 鈉鹽，pH 8.0

1 mmol/L MgCl₂

1 mmol/L MnCl₂

50 mmol/L HEPES-KOH，pH 8.0

0.33 mol/L 山梨醇

0.5 g/L BSA ( 無脂肪酸）

5 mmol/L 抗壞血酸鈉鹽（用前添加）

(3) 用兩層米拉布（Calbiochem ) 過濾勻漿。將濾液倒入兩個 250 ml 的離心瓶中。

3. 2600 g（Sorvall GSA 轉頭 4000 r/min）離心勻漿 5 分鐘。

4. 小心傾去上清。加入 2 ml GR 緩沖液。用一小駝毛刷輕輕的將瓶子內壁的葉綠體刷松。置回轉振蕩器的冰上振動 5~10 分鐘使團塊散開。

5. 將重懸浮的葉綠體加到 Percoll 梯度上。10500 g（Sorvall HB-4 轉頭的 8000 r/min）離心 10 分鐘。

6. 抽出梯度介質直到底部的條帶。將每一管中葉綠體移至一 50 ml 離心管中，用 1x SH 稀釋至 40 ml。2400 g 離心 2 分鐘（SS34 轉頭，4500 r/min）。

7. 用駝毛刷在少量 1x SH 中重懸浮沉淀。將所有葉綠體倒入一個離心管中，稀釋至 40 ml，2400 g 離心 2 分鐘。

8. 在 1~2 ml 1 x SH 中重懸浮沉淀。

9. 檢測葉綠素確定葉綠體得率。

(1) 將 5 μl 葉綠體懸液與 995 μl 80% 丙酮在一微量離心管中混勻。

(2) 13000 g 離心 2 分鐘。

(3) 檢測 663 nm 和 645 nm 處的光吸收值。

(4) 葉綠素的量（mg/ml） = （8.02 A₆₆₃ +  20.2 A₆₄₅）/5

10. 葉綠體在液氮中的長期保存。

(1) 分離好葉綠體后，立刻用含 20% DMSO 的 1x SH 將最后的沉淀重懸至葉綠素濃度為 3~5 mg/ml。

(2) 冰上放置 10 分鐘。

(3) 每 1 ml 為一份，用移液管吸至微量離心管中，快速冷凍，置液氮中保存。

11. 凍存的完整葉綠體的復蘇。

(1) 室溫融化凍存的葉綠體。用 1x SH 稀釋至葉綠素濃度為 1 mg/ml。

(2) 吸取 1~2 ml 含 35% Percoll 的 1x SH 緩沖液到一個 15 ml 的離心管中。其上加入融化的葉綠體。13000 g（Sorvall HB-4 轉頭，10000 r/min）離心 3 分鐘。棄去上清，用 1x SH 洗沉淀。