實驗材料 核酸
試劑、試劑盒 dNTPMnCl2MgCl2BSArTth DNA聚合酶
儀器、耗材 水浴鍋培養箱
實驗步驟
1. 用過氧化物酶，蛋白酶K和DNA酶預處理載玻片。
2. 配置如下一步反應體系（總體積100 μl）
（1）0.5 μl 100 μmol/l 正向引物（終濃度0.5 μmol/l）
（2）0.5 μl 100 μmol/l 反向引物（終濃度0.5 μmol/l）
（3）6 μl 3 mmol/l 4dNTP混合物（終濃度0.12 mmol/l）
（4）2 μl 10 mmol/l MnCl2（終濃度0.2 mmol/l）
（5）10 μl 25 mmol/l MgCl2（終濃度2.5 mmol/l）
（6）2 μl 10×rTth 轉錄緩沖液（終濃度0.2×）
（7）8 μl 10×螯合緩沖液（終濃度0.8×）
（8）10 μl 1.7 mg/ml BSA（終濃度0.17 mg/ml）
（9）2 μl 2.5 U/ml rTth DNA聚合酶（終濃度9.05 U/ml）
（10）29 μl DEPC處理過的水
3. 用20 μl 吸頭加8 μl（如用3孔載玻片）或12~20 μl （如用單孔載玻片）原位PCR擴增體系于各孔上，該液體覆蓋整個孔表面。
4. 放20 mm×60 mm 蓋玻片于每一載玻片上，小心用指甲油封住蓋玻片邊緣。
5. 在92℃加熱塊上，溫育玻片90 s。然后轉至熱循環儀。
6. 用步驟2所配一步反應體系代替原位PCR反應體系。
7. 按如下溫度循環程序進行反轉錄：
（1）1個循環：15 min，70℃
（2）3 min，92℃
（3）15 min，70℃
（4）3 min，92℃
（5）15 min，70℃
8. 按如下溫度循環程序進行原位PCR：
（1）29個循環：1 min，93℃（變性）
（2）1 min，53℃（退火）
（3）1 min，72℃（延伸）
（4）最后一步：不定，4℃（維持）
9. 由熱循環儀上取下載玻片，浸于100%乙醇中≥5 min 溶解指甲油，用剃須刀或其他小刀橇開蓋玻片，刮去殘留的指甲油，以便在雜交/檢測步驟中能平放上新的蓋玻片。
10. 在92℃加熱塊上溫育玻片1 min，然后于室溫下用2×SSC浸泡5 min。玻片在4℃可存敢2~3周。