體內處理精原干細胞產生轉基因小鼠的試驗方法

發布時間：2019-04-20 14:18 原文鏈接：體內處理精原干細胞產生轉基因小鼠的試驗方法

實驗概要

本試驗描述了通過體內處理小鼠精原干細胞產生轉基因小鼠的技術，其成功率高。在此次研究中通過的將幼鼠的精原干細胞（SSCS）與重組慢病毒表達的EGFP -F在體內感染，然后與正常雌性交配。轉基因可遺傳和前處理的小鼠可在多次交配試驗中使用。這項技術可以適用于模擬接近人類發展和疾病的實驗室動物模型。

實驗原理

轉基因小鼠的產生促使我們理解成長和發展的各個方面了有了巨大的進步。使用各種技術將一個單細胞胚胎植入到偽孕媽媽或用干細胞植入技術生成淘汰或基因敲除小鼠。這些實驗昂貴，勞動密集，費時和需要好幾個女的捐助者。精原干細胞是負責生產精子和合適的生殖轉換對象。Nagano等將重組逆轉錄病毒體外感染精原干細胞，然后異種移植到雄性小鼠睪丸細胞后產生轉基因小鼠產生。在某些情況下受體小鼠很難接受供體的精原細胞，其成功率是相當低的。同樣，攜帶lacZ基因的逆轉錄病毒與睪丸生殖細胞的體內轉導，其成功率為2.8％。植入后的低成功率阻礙了胚胎植入。但是使用慢病毒的實驗，能提高其成功率。

主要試劑

慢病毒pLKO.1 EGFP-F12。病毒滴度可以從 10⁵~10⁶ TU/ml。

麻醉劑：使用50mg/ml鹽酸氯胺酮和20mg/ml二甲苯胺噻嗪鹽酸鹽的混合物，并用生理鹽水稀釋至終濃度二甲苯胺噻嗪鹽酸9g/L，鹽酸氯胺酮1.6g/L。

其他化學品：Tris-HCl，臺盼藍染料，十二烷基硫酸鈉（SDS），氯化鈉（NaCl），EDTA，蛋白酶K，多聚甲醛，甘油，氨芐青霉素（鈉鹽）和卡那霉素，以上試劑均購于Sigma公司；dNTPs 購于Promega公司；Taq聚合酶購于New England Biolabs公司。

主要設備

動物麻醉系統（拉斯，型號901807，VetEquip公司）

光纖照明體視顯微鏡（尼康公司）

PCR儀分光光度計

UV-2450紫外可見分光光度計（島津公司）

實驗材料

試驗動物：任何品系的小鼠都可以使用。公鼠最好選擇一月齡。本實驗選擇28-32日齡小鼠（CRL：CFW），重約20-25克。

動物飼養：按標準配方和無菌水飼喂；環境溫度保持在23±20^。C；相對濕度：40-70％；光線：7:00至19:00有光線； 19:00至7:00暗室。

實驗步驟

1. 制備高滴度pLKO.1 EGFP-F PURO慢病毒載體。

1)將產生的 LVs，溶解于DPBS溶液。慢病毒的生物效價決定于受感染的不同濃度病毒稀釋的HEK-293細胞，病毒一般為10⁵~10⁶ TU/ml。

注意：

a. 病毒應分裝保存在80℃，可以保存至少1年且病毒滴度無明顯改變，在-80℃。如果病毒在一星期內使用，可以儲存在4℃。

b. 慢病毒能夠感染人體細胞。應穿戴手套和防護服裝。避免泄漏和飛濺。慢病毒不穩定，容易被乙醇，清潔劑或漂白劑溶解。任何泄漏或工作完成后，用乙醇或漂白劑消毒工作區。

2. 體內傳導所需的基因在睪丸

注意：所有的動物實驗研究，應按相關的指導規則，在相應的權限和規定內執行。以下所有步驟應在無菌環境下進行。

1) 向日齡28雄性小鼠腹腔內注射三溴乙醇（Avertin）（Sigma公司）（2,2溴乙醇和T-戊醇，按體重0.015ml/gm），關鍵步驟防止麻醉過量，不當的麻醉劑量可使動物致死。

2) 從小鼠腹股溝區剃毛和消毒。無菌條件下選擇陰莖前方，正中線皮膚切口，中央切口是首選的手術方法，一個切口取出兩個睪丸。

3) 切開肌肉后，在彎夾鉗的幫助下剝離與腹腔睪丸連著的脂肪層。

4) 使用30號針頭的注射器刺破睪丸組織，向睪丸間的管狀空間內插入含臺盼藍染料（0.04％）LV的30號針頭。添加臺盼藍監測在刺入睪丸的準確性。

5) 向睪丸緩慢注入約10-20mL LV液。

注意：每次注射后，等待30秒后拔出注射器以防止LV回流。注入DNA液的總體積不宜超過20μL，大量注射的慢病毒可能會使睪丸破裂。

6) 將注射后的睪丸放回原位，由手術摘除對側睪丸，縫合內部和外部的傷口。

注意：在手術中，不摘除連同睪丸的脂肪或任何其他組織。要用無菌尼龍線結扎血管，防止出血，小心不要弄破睪丸。

7) 在縫線的部位涂抹抗生素軟膏（新霉素和多粘菌素B硫酸鹽和桿菌肽鋅粉，Glaxo Smith Kline，印度），保持小鼠于熱板上約1h，麻醉中的動物容易蘇醒。

3. 轉基因株系的建立

注：在小鼠實驗中，它需要30天左右完成一個精子的周期：從精原細胞到精子。

1) 注射后LV30天進行交配，注射的動物與2個月齡的野生型（WT）雌性動物交配，幼畜出生后通常在22-30天交配。

2) 從3周齡鼠取尾2-75px進行活組織檢查，將其培育在他們在高鹽的消化緩沖（50 mM Tris HCl，1％SDS，100mM NaCl，100mM EDTA和1200μg/ml蛋白酶K）中，55^oC，16h。

注意：將20mg蛋白酶K溶解于1mL無核酸酶水中。分裝蛋白酶K，并保存在-20°C，任何凍融可能會使蛋白酶K的失活。

3) 裂解分離DNA，酚氯仿萃取，乙醇沉淀。

注意：苯酚和氯仿對健康造成危害，戴上手套和保護眼睛。

4) 用紫外分光光度計檢查A260nm處260nm / 280nm的比值定量DNA濃度的和純度。

5) 稀釋DNA濃度至200ng/μl和進行PCR。

4. 采用聚合酶鏈反應（PCR）篩選轉基因小鼠

1) 準備一個最佳的反應混合物體中： 1X Taq酶緩沖液，0.2mM dNTPs，0.25μM上、下游引物， 0.06U的TaqDNA聚合酶和20ng質粒或200ngDNA基因組模板。混勻后短暫離心。Peltier Thermal Cycler PTC-200預熱液體后開始鏈式反應。(MJ Research, Minnesota, USA).

2) 設置引物的PCR循環條件。根據1.5％-2％TAE瓊脂糖凝膠分析PCR產物。

注意：每次PCR，野生型基因DNA和無DNA（模板）作為陰性對照，表達轉基因的純化質粒作為陽性對照。

3) 從F1代起，PCR陽性幼鼠應與野生型雌性交配產生下一代。通過近親繁殖轉基因后代產生純代系。