正在著手做 real-time PCR 的朋友們，我想最開始肯定要考慮引物設計的問題。
看完下面的文字，我保證你得到想要的引物設計方法和引物序列。
第一步：拿到你所要研究的基因的序列。不要告訴我你不會找序列。如果真的不會，請參考丁香園內其他版塊，如NCBI使用，序列查找等。
第二步：確定你想用哪種方法。Taqman Probe 還是 SYBR 染料？
兩種方法各有利弊，這里不贅述，不明白的依然參見其他版塊。但需要指出的是，后者在國內更常用，因為比較簡單，容易操作，容易分析。建議初學者選擇。
第三步：動手設計引物
1）兩種引物設計軟件。
在設計 real-time PCR 引物時，常用的有非常 NB 的 primer premier 5.0 和 primer express 3.0 (升級版有5.0)。前者可以應用與常規PCR和real-time PCR；后者是ABI公司的real-time PCR儀器配套的引物設計軟件，專門為real-time PCR設計。
2）選擇哪個軟件合適？
在第二步中，我已經說過，你要先確定你選擇哪個方法。如果你想用 Taqman Probe 法，請你選擇 primer express 3.0。如果你想用 SYBR 法，我建議你選 primer premier 5.0。
為什么？請往下看。
3）兩種引物設計軟件之比較。
先說專門為 real-time PCR 定制的 primer express 3.0 。這個軟件其實是為 Taqman 探針法設計的，而不適合SYBR染料法。
如果你用探針法，強烈推薦。打開軟件就會發現，在方法選擇的下拉菜單中，都是 Taqman 探針法，沒有染料法。結果導致，在你進行引物遴選的時候，都要考慮到「位于上下游引物之間的探針，以及探針與上下游引物的聯系」］最終把條件限制的很窄。而染料法相對于探針法，條件相對寬泛。最終，你得不到滿意的染料法的引物。在升級版中，是否有解決，我不知道，也沒用過升級版。
由于primer express 3.0 的局限性，使得采用染料法的朋友們，不得不求助于 primer premier 5.0。具體使用方法可以在論壇里搜索。但是，需要一些遴選條件。見下面的附件。
第四步：如果你比較懶，自己又學不會用軟件。
那么，請你求助有強大的 google 和百度。搜索模式：A（你所關注的基因名稱）+B（real-time PCR）google 或A（你所關注的基因名稱）+C（熒光定量PCR）百度。然后下載那篇文章，找到你要的序列的引物。
第五步：如果沒有人比你更懶，那么，請你在丁香園的引物板塊尋找你的引物是否有人提供到數據庫了，如果找不到（相信大部分找不到），那你發帖求助。
第六步：我把我找到的，驗證比較好的 β-antin 熒光定量PCR引物和 GAPDH 熒光定量PCR引物（SYBR法）分享。大家參考。