免疫沉淀實驗原理、儀器試劑和操作步驟

（一）原理

免疫沉淀是利用抗原抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法。抗體與細胞裂解液或表達上清中相應的蛋白結合后，再與蛋白 A／G（Protein A／G）或二抗偶聯的agaose或Sepharose珠子孵育，通過離心得到珠子－蛋白A／G或二抗－抗體－目的蛋白復合物，沉淀經洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5－10 min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。

（二）試劑

1．PBS：8g NaCl、0.2 g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800 ml雙蒸水中，用HCl調PH至7.4，在補加水至1L，高壓滅菌后保存于室溫。

2．NaCl：5.8 g NaCl溶于 80 ml雙蒸水中，再補加水至100 ml，高壓滅菌。

3.1 1M Tris（pH 7.5）: 12.1g Tris堿，溶于80 ml雙蒸水，用 HCl調 pH至7.5，再補加水至100 ml。

4．蛋白酶抑制劑：Aprotinin和Leupeptin溶于雙蒸水，PMSF溶于異丙醇，濃度均為10 mg/ml。

5．N-40：10％（w／V）。

6．脫氧膽酸鈉：10％（w／v），溶于10 mM HEPES（pH 8.0）。

7．細胞裂解液：50 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.1 mg/ml PMSF、1 ug/ml Aprotinin、1ug/ml Leupeptin、l％NP-40、0.5％脫氧膽酸鈉。

8．稀釋液：50 mM Tris（PH 7.5）、150 mM NaCl、0.1 mg／ml PMSF、1 ug／ml Aprotinin，1 ug/mlLeupeptin、0.1％NP-40。

9．洗滌液 Ⅰ：50 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.1％NP-40。

10．洗滌液Ⅱ：10mMTris（pH 7.5）。

11．ProteinA／G－Agarose。

12．2×SDS－PAGE電泳上樣緩沖液：100 mMTris（pH 6.8）、200 mM DTT、4％SDS、0.2％溴酚藍、20％甘油。

（三）操作步驟

1．離心收集細胞，PBS洗滌2次。細胞用量根據目的蛋白表達的水平而定，一般用 1×107－5×107 細胞。

2．按 1×107 細/ml加人細胞裂解液，于冰浴上超聲破碎，然后再冰浴 30 min。

3．4℃ 12 000 ×g離心 10 mn，取上清。

4．往上清中加人50 ul的蛋白 A／G－agarose，于4℃在搖床上溫和搖1－3 h進行預清除。

5．12 000轉離心20 s，取上清。

6．將上清等分成兩份，補加稀釋液至1ml，其中一份加人1－10 ug識別目的蛋白的抗體，另一份加人等量的對照抗體，于4℃在搖床上溫和搖2 h，然后加入50 ul的蛋白A／G－Agarose于4℃在搖床上溫和搖過夜。

7．離心棄上清，用洗滌液Ⅰ洗沉淀4次，洗滌液Ⅱ洗 2次，每次洗滌于4℃在搖床上溫和搖20 min。

8．離心棄上清，用4號針頭盡可能移去液體。

9．加人20－50 ul的電泳上樣緩沖液，于100℃煮5－10 min，離心收集上清。上清中含有目的蛋白和抗體，可進一步用蛋白電泳和Western blot進行定性和定量。
四）注意事項

1．不同種屬來源及不同亞類的抗體與蛋白A和蛋白G的－結合力不同（表），有的甚至不能結合，如小鼠的 IgM，這類抗體不能用蛋白 A／G－agarose直接免疫沉淀。

2．PMSF對身體有害，注意防護。

3．根據免疫沉淀的結果，洗滌液Ⅰ的鹽離子濃度可作一定的調整，如果沉淀的雜蛋白較多可適當增加鹽濃度，如果抗體與目的蛋白的結合力較弱則適當減低鹽濃度。

不同種屬和不同亞類抗體與Protein A、Protein G的結合力

w：Weak binding，S：Strong binding，w／s：Indifferent，

nb：No binding，—：Information not available