免疫PCR

主要由兩個部分組成，第一部分的免疫反應類似于普通的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的測定過程；第二部分即通常的PCR檢測，抗原分子的量最終由PCR產物的多少來反映。第一步中，首先用待測抗原（如牛血清白蛋白（ESA））包被微滴板孔，再加入相應的特異抗體，于是抗體就與固相上的抗原結合形成抗原抗體復合物，蛋白A-鏈親合素（Protein A-Streptavidin）嵌合體（重組融合蛋白）中的蛋白A部分可與固相上抗原抗體復合物中的抗體IgG結合，而鏈親合素部分可與生物素化的pUC19（質粒DNA) (Biotin-pUC19）中的生物素反應，從而將特定的DNA間接吸附于固相。接下來，就是第二步中的PCR過程，第一步中吸附于固相的pUC19質粒DNA在相應的引物存在下，可經PCR在幾小時內而放大數百萬倍，PCR產物的多少與固相上抗原的量成正比。
 

PCR由以下五部分構成：
（1）待測抗原；
（2）生物素化抗體；
（3）親和素（連接分子）；
（4）生物素化DNA；
（5）PCR擴增。

主要程序：

（1） 抗原+生物素化抗體→抗原-生物素化抗體復合物；

（2） 加親合素→抗原-生物素化抗體-親合素復合物；

（3） 加生物素化DNA→抗原-生物素化抗體-親合素-生物素化DNA；

（4） PCR擴增生物素化DNA部分。

抗原樣品

包被緩沖液 洗滌液 稀釋液 瓊脂糖凝膠

微滴板 電泳儀 電泳槽

一、制備生物素化DNA
 

將噬粒 BLuescript skt，用生物素標記的M13引物進行PCR擴增制備出含T3和T7引物序列的280 bp DNa段，即為生物素化DNA。
 

二、免疫PCR模式
 

1.  試劑
 

包被緩沖液：20 mmol/L Tris-HCI（pH9.5），含150 mmol/L NaCl和0.02%NaN₃；
 

洗滌液：20 mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150 mmol/LNaCl 0.1 mmol/L EDTA和0.1%Tween20；
 

稀釋液：20 mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150 mmol/L NaCl 0.45%脫脂奶及變性鮭魚精DNA （0.1 mg/ml）。
 

2.  操作
 

（1） 包被
 

用包被緩沖液稀釋抗原（BSA），加入微滴板中（45 μl孔），4℃過夜（約15 h），用洗滌液洗板3次×5 min。
 

（2） 封閉
 

每孔加200 μl含4.5%脫脂奶及變性鮭魚精子DNA（1 mg/ml）、0.1 mmol/L EDTA的20 mmol/L Tris-Hcl（pH7.5）（含150 mmol/L NaCl緩沖液，37℃溫育80 min，洗板數次。
 

（3） 抗原抗體反應
 

用釋釋液1:8 000稀釋單克隆抗BSA抗體，每孔加50 μl，室溫（22℃）下45 min，洗板孔15次×10 min，去除未結合的抗體分子。
 

（4） 鏈親合一蛋白A結合反應
 

每孔加入50 μl用稀釋液稀釋的已與生物素-pUC19結合的鏈親合素-蛋白A嵌合體，室溫（22℃）50 min，使得嵌合體-pUC19結合于固相的抗原抗體復合物上，然后洗板15次×10 min，再用無NaN3的TBS洗3次，然后即可將微滴板用于后面的PCR反應。
 

（5） PCR
 

實驗條件 50 mmol/L KCI、10 mmol/L Tris-HCI（20℃pH8.3）、1.5 mmol/LMgCl₂、明膠（10 μg/ml）、0.8 mmol/LdNTPs（每種0.2 mM）、2 μM引物（每一引物1 μM）和TaqDNA多聚酶（50 U/ml）。
 

三、PCR周期
 

PCR前，用紫外線（UV）（254 nm）照射上述反應混合物，然后將之加入到微滴板孔中，每孔40 μl，再加20 μl UV照射的石蠟覆蓋，按下述溫度在PCR儀上進行PCR周期：起始變性94℃5 min；30個周期：變性94℃5 min，退火58℃1 min，延伸72℃1 min，最后延伸72℃ 5 min，得到的PCR產物為特定的261 bp的片段。
 

1.  用0.85% NaCl將細菌溶液稀釋至一定濃度；
 

2.  加50 μl于微孔板內，4℃過夜。同時設陰性對照（加50 μl 0.85% NaCl于另一孔內）；
 

3.  用400 μl的0.05% 溫20pBS（以下簡稱TPBS），洗滌五次；
 

4.  加入2.25%的100 μl正常山羊血清（NGS） PBS封閉2小時；

⒌  用含0.15% NGS的TPBS洗3次；

6.  加入100 μl用0.75% NGS適當稀釋的單克隆抗體（內含100 μg的鮮魚精DNA），室溫孵育30 min；
 

7.  用TPBS洗滌五次；
 

8.  加入50 μl適量稀釋的生物素化抗鼠IgG抗體，室溫孵育30 min；
 

9.  用TPBS洗滌五次；
 

10.  加入60 μl適量稀釋的生物素化DNA和親和素，室溫孵育30 min；
 

11.  用TPBS洗滌五次，再用HPLC級水洗三次；
 

12.  PCR擴增：加入50μl PCR反應液（內含T3和T7引物），95℃ 60 s，50℃ 110 s，72℃ 110 s，循環30次。取PCR產物10 μl于1.7%瓊脂糖凝膠上電泳，和核酸分子量標準相比較，在相應的位置郵現電泳帶為陽性。必需時將電泳結果照像，進行定量分析。

一、發展
 

免疫PCR技術目前尚處于研究階段，還沒有一個十分成熟和滿意的方法，配套試劑尚缺乏，所以應用的還不多，在報道的幾種方法中均是用一些已知的標準品進行試驗。Sano，Ruzicka和Hong zhou分別用牛血清白蛋白、小鼠IgG和重組人原癌基因產物ETS；蛋白作為待檢抗原進行免疫PCR，他們的結果均表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，且PCR產生的背景信號很弱，可以檢測到幾百個分子的抗原，在理論上免疫PCR可以檢測到一個分子抗原，因此，免疫PCR特別適用于檢測一些含量特別少的抗原分子。目前介紹的免疫PCR還存在一些缺點，在報道的文獻中均采用待檢抗原直接吸附固相，這樣固相的均質性必然對結果有很大的影響；同時檢測的樣品液中其它成分也可以吸咐固相，極易產生背景過高或精確度下降。另外，有些難于吸咐固相的抗原也就不能用免疫PCR檢測，連接分子的特異性和均質性對PCR影響很大，從理論上看Hong zhou的生物素標記抗體和DNA以及用游離的鏈親和素連接抗體和DNA是一比較理想的方法，但是如能做到生物素化抗體、親和素和生物素化DNA3個分子預先連接一個復合物，那么將簡化實驗過程。PCR擴增過程相對簡單，如用微量板作為固相需選用配套的PCR儀，否則需將其移入反應管內，這必然導致很大的誤差，經放大可產生顯著差異。固相也可以直接采用某些PCR反應管，并且可以直接用一般的PCR儀進行擴增，但沖洗過程相對復雜一些。免疫PCR具有非廣泛的應用前景，十分有必要進一步完善免疫PCR的實驗過程和配套試劑的研制。
 

二、應用
 

熒光PCR是分子診斷的熱點技術，它將先進的定量PCR與實時PCR技術相結合，西安天隆生產的國產實時熒光定量PCR儀為肝炎艾滋病等重大疾病的定量核酸檢測及分子診斷、同時也為沙門氏菌阪崎氏腸桿菌等食品安全檢測提供了先進手段。即使在發達國家，熒光定量PCR儀和基因擴增儀都被廣泛用于臨床及生物學、醫學研究。由于其極高的靈敏度、極寬的檢測范圍，以及精確定量、方便快速、無窗口期等優點，美國FDA及中國國家標準已將定量PCR儀規定為確診禽流感等傳染病以及奶粉等食品安全檢測的必備儀器。