關于聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠的制備和電泳介紹

　　一、凝膠的制備和電泳

　　由于氧能抑制丙烯酰胺的聚合反應，灌制聚丙烯酰胺凝膠常在兩塊封閉的玻璃平板所形成的夾層間進行。在這種裝置形式下，僅有頂層的凝膠與空氣中的氧氣相接觸，從而大大減少了氧對聚合的抑制作用。聚丙烯酰胺凝膠電泳一般采用垂直裝置。

　　二、凝膠的制備和電泳操作如下：

　　(1) 配制試劑

　　① 30%丙烯酰胺：100ml雙蒸水中含29g丙烯酰胺和1g N，N’-亞甲雙丙烯酰胺。

　　② 5×TBE

　　每升溶液含54g Tris.HCl，27.5g硼酸和20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)。

　　③ 10%過硫酸銨：10ml雙蒸水中含1g過硫酸銨。

　　(2) 裝置膠模

　　將玻璃板和墊條事先用去污劑刷洗，并經自來水和無離子水沖洗干凈，晾干。裝置時，將較大的玻璃板平放在工作臺上，將兩個墊條放在玻璃板兩側，涂上少量凡士林，并將上層玻璃板置于墊條上，用夾子將玻板連同墊條夾緊，底部用1%瓊脂糖密封。為防止漏膠，除放梳子一邊外，其余三邊應用防水膠帶密封。

　　(3) 根據玻璃板大小及夾層厚薄計算所需凝膠溶液量，按下表配制溶液(100ml)。

　　將35μl TEMED加入100ml混合液中，混勻，然后均勻連續注入兩玻璃板空隙中。

　　(4) 立即插入電泳梳，勿使梳齒下形成氣泡。

　　(5) 室溫聚合1小時，梳齒下出現折光帶時，表明聚合反應已經完成。若凝膠不立即使用，可用紗布或濾紙(用1×TBE浸泡)包蓋于凝膠頂部，置4℃保存1-2天。

　　(6) 拔去梳子，立即用水沖洗加樣孔。

　　(7) 除去底部膠帶，將凝膠直立放入電泳槽。在上下兩槽中灌好1×TBE溶液，驅盡凝膠底部附著的氣泡。并用1×TBE溶液沖洗加樣孔；

　　(8) 將核酸樣品與適量6×凝膠加樣緩沖液(見表2-28)混合，并加入凝膠加樣孔中；

　　(9) 接通電源，正極與下槽連接。電壓一般控制在1.8v/cm。電壓過高時凝膠產生的熱量可造成DNA區帶彎曲，甚至引起小DNA片段的解鏈；

　　(10) 電泳畢，取下玻板和凝膠，放在工作臺上，從夾層一角輕撬，將上面的玻板輕輕移開，并小心揭下凝膠，置染色液中染色并進行結果觀察。