1、毒素檢測：
組織細胞毒素檢測被認為是診斷的金標準，需時48小時，敏感性高，且能檢測毒素。
2、細菌培養：
用環絲氨酸頭孢西丁果糖瓊脂培養基進行厭氧培養，需時72小時，靈敏度高且可獲得菌株，不能檢測毒素。
3、谷氨酸脫氫酶檢測：
谷氨酸脫氫酶是艱難梭菌與梭菌屬其他細菌共同的非毒素蛋白質，采用乳膠凝集試驗，操作簡單快速（15-45分鐘），敏感性略低，且與其他厭氧菌存在交叉反應。
4、基因診斷：
采用聚合酶鏈技術可檢測A毒素、B毒素、二元毒素以及高毒力的菌株，敏感性高。
5、膠乳（凝集）試驗（latex test）：
膠乳綁定抗體后，加入過濾后的糞便濾液，觀察起凝集結果。
6、掃描試驗（screening test）：
測試普通抗原后，跟隨其他特定試驗。病人的病史是重要的參考標準。
測試普通抗原可以測定產生毒素的艱難梭菌和不產生毒素的梭菌，也是診斷假膜性腸炎（PMC），抗生素相關腹瀉（AAD） 的方法。確定仍需其他特定的方法。
7、酶聯免疫吸附測定（ELISA）：
是敏感性極高的鑒定方法，由于其設備昂貴則不作為基礎檢測。優點為敏感和特異性高，得到結果的時間短。