農桿菌介導的植物遺傳轉化

農桿菌介導的植物  遺傳轉化　　
【目的】：學習和掌握共培養過程關鍵技術環節及轉基因植株的篩選。　　
【要求】：以煙草葉片為材料，與對數生長期的帶有外源基因的農桿菌共培養，遺傳轉化煙草葉片，篩選抗性再生植株。　　
【內容】：1、煙草無菌苗的準備　　
2、帶有外源基因農桿菌的培養　　
3、煙草葉片與對數生長期農桿菌的共培養　　
4、抗性再生植株的篩選　　
【用具】：超凈工作臺、搖床、恒溫培養室、高壓滅菌器、冰箱、培養瓶，培養皿、500 mL三角瓶、50 mL與500 mL燒杯、酒精燈、槍形鑷子、手術刀。　　
【藥品與水】：① 按照培養基要求準備藥品；② 材料表面消毒劑：70%乙醇0.1% HgCl2③ 無菌水；④ 卡那霉素（kan）、羧芐青霉素(Cb)；⑤ 帶有外源基因的農桿菌由實驗室提供。　　
培養基: 1、LB培養基100ml； 2、MS 鹽溶液（pH 7.0）100ml,分裝到50ml三角瓶中，25ml/ 瓶；3、 MS基本培養基 500ml(固體)； 4、分化培養基 MS+NAA 0.2 mg/l +6-BA 3 mg/l，500ml （固體），分裝在250ml三角瓶中，每瓶100ml；高壓滅菌　　
抗生素母液：Kan 100mg/ml 5ml ; Cb 500mg/ml 5ml 抽濾滅菌，分裝在Ep 管中，每管1ml, -20℃保存。　　
實驗材料】：煙草無菌苗葉片。　　
【方法】：　　
1. 取普通煙草無菌苗葉片，用鋒利手術刀片切去邊緣和主葉脈，葉片切成0.5 cm見方的小塊（使四周均有傷口），備用。　　
2. 取培養過夜的農桿菌LBA4404（含有卡那霉素抗性基因，Gus基因）菌液，4,000 rpm，室溫離心10 min，用MS鹽溶液（pH 7.0）重新懸浮菌體，使用時用MS鹽溶液稀釋至原體積的20-50倍。　　
3. 將準備好的的葉圓片在菌液中感染10 min后，將葉片取出,用無菌濾紙吸去植物材料表面菌液,轉移到鋪有一層無菌濾紙的MS培養基上，28℃暗培養，共培養3-7天。　　
4. 共培養后將材料轉移到含有抗生素的分化培養基（篩選培養基） ( MS+NAA 0.2 mg/l 　　
+6-BA 3 mg/l+ Kan 100 μg/ml+ Cb 500 μg/ml)培養，每15天繼代一次.　　
5．待抗性芽長到2-3 cm時切下，轉至1/2 MS固體培養基上，生根培養基 (1/2MS+Kan 100 　　
μg/ml+ Cb 500 μg/ml)誘導生根。　　
6. 利用生物化學和分子  生物學方法檢測這些轉基因植株。　　
每組用農桿菌介導法接種煙草葉片1平皿。