農桿菌感受態的制備和轉化

農桿菌重組質粒

鏈霉素YM液體培養基CaCl2溶液甘油

離心管Eppendorf管冰箱冷凍離心機接種環錐形瓶

一、農桿菌感受態細胞的制備

1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml鏈霉素平板劃線，28℃培養。

2. 挑取單菌落接種于5ml YM液體培養基中，220rpm 28℃振蕩培養12-16 hr。

3. 取2ml菌液轉接于100ml YM液體培養基中，28℃ 220rpm振蕩培養至OD600=0.5。

4. 轉入無菌離心管，5000rpm離心5min,去上清液。

5. 加入10ml預冷的0.1M的CaCl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置20min。4℃5000rpm離心5min，去上清。

6. 加入4ml預冷的含15%甘油的0.1M的CaCl₂溶液，輕輕懸浮。

7. 農桿菌懸浮液分裝于無菌Eppendorf管中，每管200μl凍存于-70℃。

二、雙元載體轉化農桿菌EHA105

1. 取1 μg左右的質粒DNA加入到200 ml EHA105感受態細胞中，混勻后，冰浴30min，-70℃放置10min 。

2. 再在37℃水浴5min或42℃水浴1min。

3. 接著冰浴2min，加入800ml YM液體培養基。

4. 28℃，175rpm搖培3 hr后，涂在含50 μg/ml Kanamycin的YM平板上。

5. 28℃培養到形成單菌落。

注：其中 YM 可以用LB 代替 ，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl₂   0.01Tris-HCl（7.0） 0.01 DTT）替代。