冷凍電鏡單粒子法

三維冷凍電子顯微術已經在確定結構組成和大分子復合物的結構層次方面取得了重要進展。單粒子冷凍電鏡技術是獲得三位重構圖像的重要的方法。單粒子法就是對分離純化的顆粒狀分子進行結構分析。既可以對有二十面對稱結構的病毒或螺旋對稱結構進行分析，也可以對象核糖體等大的可溶性復合物進行結構分析，還可以對溶解狀態的膜蛋白進行分析。其基本原理是通過對相同的生物大分子某方向的投影顯微像在時空中經調整后進行疊加，從而提高信噪比，最后將不同投影方向的單顆粒顯微像在三維空間進行重構獲得單顆粒大分子的三維結構信息。主要步驟可分為以下幾點：

1、制備化學和結構上均一的生物大分子的冰凍含水樣品，

2、選擇最有可能能夠產生最佳圖像的最佳的顆粒密度和玻璃態冰厚度的樣品，

3、設定最佳的參數（比如：欠焦值、放大倍數和電子劑量等）記錄這些樣品區域的大量圖像，

4、用手工或半自動程序選擇那些離散的分子形成的投影圖，

5、通過計算不同圖像之間的相對方位來重組出復合物的三維結構模型。

6、最后可以利用從晶體學或NMR獲得的結構將原子坐標定位到密度圖中。

為了使結構的分辨率接近10 或更高，也可以對在分離的和復合的大分子環境細微的結構差異進行校正不用結晶是該方法的最大優點，而且對于研究傳統方法不易研究的大分子復合物像核糖體有很大優勢。

由于低劑量的電子輻射使得圖像的信躁比(SNR)非常低，要提高信躁比，就必須采集更多的圖像數據，通常要求>10 000張，才能滿足分子分辨率的要求，而要獲得原子分辨水平（~4 ）的結構需要上百萬張圖像，若要人工處理這些數據將是一項耗時乏味的體力活，也因此成為冷凍電鏡獲得高分辨圖像的一個瓶頸，因此需要發展自動化采集單離子圖像的方法，該方法發展將成為冷凍電鏡領域里一項重要課題。Nicholson, W.V.等人在2001年的綜述中把幾種不同的單粒子選擇方法歸納為五類:1、Template-based 方法;2、edge detection-based 方法;3、Intensity comparision方法;4、Texture-based方法;5、Neural network方法。近來大量研究小組在該領域里取得了重要的進展，出現了一些改進的方法，比如learned-based 方法,TYSON local variance方法, 兩步法等。Journal of Structural Biology 145(2004) 這一期集中介紹了在單粒子法中圖像自動采集方法的研究進展。盡管運用冷凍電鏡單粒子法還無法獲得足夠高分辨率的三維結構以建立條帶結構模型，但測定的結構中可達到的分辨率已小于10 。隨著計算機圖象處理技術的發展尤其是圖象自動采集技術的應用，數據收集會越來越快，分辨率也會逐步提高。

想要將三維冷凍電鏡方法建立為測定三維結構的常規方法理論上，除了在顆粒圖像選擇方法上建立自動化技術外，還需要在各個步驟進行改進，實現自動化過程。包括樣品制備，數據收集，結構校正，以及將X-ray圖與電鏡密度圖重疊已獲得更全面的信息。其中一些已取得了一定的進展. 圖像探測技術對分辨率也有很大影響新一代的4K×4K CCD（charge-coupleddetector）照相機可以在120KV電壓下在10-15 分辨率水平上進行掃描拍攝圖像，并且可以在低放大倍數下從中央記錄圖像并確定玻璃化冰的厚度