冷凍電鏡技術為何摘得2017年的諾貝爾化學獎

2013年，冷凍電鏡技術的突破給結構生物學領域帶來了一場完美的風暴，迅速席卷了結構生物學領域，傳統X射線、傳統晶體學長期無法解決的許多重要大型復合體及膜蛋白的原子分辨率結構，一個個被迅速解決，紛紛強勢占領頂級期刊和各大媒體版面，比如程亦凡博士、施一公博士、楊茂君博士、柳正峰博士所解析的原子分辨率重要復合體結構，震驚世界。

這場冷凍電鏡革命的特點是：不需要結晶且需要樣品量極少，即可迅速解析大型蛋白復合體原子分辨率三維結構。這場電子顯微學分辨率革命的突破有兩個關鍵技術：直接電子相機（其中算法方面程亦凡博士和李雪明博士有重要貢獻）和三維重構軟件。

引領這些技術突破的背后離不開三位冷凍電鏡領域的開拓者：理查德·亨德森（Richard Henderson）、約阿希姆·弗蘭克（Joachim Frank）和 Jacques Dubochet分別在基本理論、重構算法和實驗方面的早期重要貢獻。

我本人與這三位科學家都有曾過面對面的交流，也是讀他們的文章進入這個領域的，下面簡要談談他們的貢獻。

電子顯微鏡于1931年發明，但在生物學領域的應用滯后于材料科學，原因在于生物樣品含水分才會穩定，而電子顯微鏡必須在高真空下才能工作，因此如何制作高分辨率生物電鏡樣品是個技術瓶頸。傳統的重金屬負染技術，可以讓重金屬包被蛋白表面，然后脫水干燥制作適合真空成像的樣品，但這會導致樣品分辨率降低（至多保存1.5納米）。

1968年，英國劍橋大學MRC實驗室的Klug博士和他的學生DeRosier開創了基于負染的噬菌體病毒的電鏡三維重構技術（Klug 博士獲1982年諾貝爾化學獎）。但如何保持生物樣品原子分辨率結構又適合電鏡成像呢？加州大學伯克利分校的Robert Glaeser博士和他學生Ken Taylor 于1974年首次提出并測試了冷凍含水生物樣品的電鏡成像，可以有效降低輻照損傷對高分辨率結構破壞和維持高真空，實現高分辨率成像的新思路，這就是冷凍電鏡（CryoEM）的雛形。

? 冷凍電鏡樣品制作流程，圖片來自creative-biostructure.com

1982年，Dubochet 博士領導的小組開發出真正成熟可用的快速投入冷凍制樣技術制作不形成冰晶體的玻璃態冰包埋樣品，隨著冷臺技術的開發，冷凍電鏡技術正式推廣開來。

在Klug博士提出的三維重構技術基礎上，MRC實驗室的Richard Henderson博士（物理學及X射線晶體學背景）跟同事Unwin 博士1975年開創了二維電子晶體學三維重構技術，隨后應用該技術技術解析了第一個膜蛋白細菌視覺紫紅質蛋白的三維結構，1990達到3.5埃，這是一個非常了不起的工作，但是第一個類似的膜蛋白結構的諾貝爾獎還是被X射線晶體學家米歇爾于1988年奪走了。二維晶體最大問題在于很難長出二維晶體，因而應用范圍很窄，且容易被X射線晶體學家搶了飯碗（本人剛入行第一個薄三維晶體項目就被搶了）。

上世紀90年代，Henderson博士轉向了剛興起的另一項CryoEM三維重構技術，即Joachim Frank 博士發展的單顆粒分析重構技術，無需結晶就可以對一系列蛋白或復合體顆粒直接成像，對位平均分類，然后三維重構。Henderson 博士憑借他深厚的物理學及電子顯微學功底，以及非凡的洞察力，提出實現原子分辨率CryoEM技術的可行性，在理論上做了一系列超前的預見，比如電子束引起的樣品漂移必須解決才能實現原子分辨率，為后期直接電子相機的突破指明了方向，他本人也投身于直接電子相機的開發。

因此，在這場電鏡分辨率的革命中，Henderson博士是個不折不扣的發起者。另外，三維重構新算法的突破也有Henderson 博士的獨具慧眼有關，Sjors Scheres博士在沒有很強論文情況下被他看中招募到MRC后因為開發經典的Relion 三維重構算法大放異彩。

最后，我們再介紹一下發展冷凍電鏡單顆粒三維重構技術的Joachim Frank博士，他也是物理學背景。Frank 博士是單顆粒分析鼻祖，單顆粒三維重構算法及軟件Spider的作者。

Frank 師從德國著名的電子顯微學家Hoppe博士，Hoppe學派主張對任意形狀樣品直接三維重構，后來的電子斷層三維重構及cryoEM三維重構技術都與他的早期思想有關。Frank博士提出基于各個分散的全同顆粒（蛋白）的二維投影照片，經過分類對位平均，然后三維重構獲得蛋白的三維結構，發展了一系列算法并編寫軟件（SPIDER）實現無需結晶的蛋白質三維結構解析技術。尤其在核糖體三維重構方面有一系列的重要開創性工作，可惜當年核糖體結構諾貝爾獎沒有給他。現在給他在cryoEM單顆粒三維重構的一個諾貝爾獎，實至名歸。