分子雜交技術（二）

四、核酸探針的標記和檢測

　　分子雜交是核酸鏈間堿基配對規則的一種結合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子雜交這一特性來對特定核酸序列進行檢測，必須將雜交鏈中的一條用某種可以檢測的分子進行標記，這條鏈就稱為核酸探針。因此，核酸探針的制備是分子雜交技術的關鍵。最早采用的也是目前最常用的核酸探針標記方法是放射性同位素標記。常用的放射性同位素有32P和35S前者能量高，信號強，最常用。放射性同位素標記探針雖然敏感度高，但卻存在輻射危害和半衰期限制（32P半衰期為14.3天，35S半衰期為87.1天，125I的半衰期為60天），3H的半衰期長達12.3年，但它所釋放β放射線能量太低（0.018Mev），只能用于組織原位雜交。由于同位素標記的探針在使用過程中存在著上述缺點，近些年來，人們在尋找非航船性標記物方面取得了很大進展，國際上已有多家公司相繼推出多種非放射性探針標記試劑盒，在國內也已具備生物素類標記物的生產能力，并有相應試劑出售。目前，非放射性標記物有下述幾類：金屬如Hg，熒光物質如FITC；半抗原如地高辛；生物素；酶類如辣根過氧化物酶（HRP）。半乳糖苷酶或堿性磷酸酶（AKP）等。不同的標記物，所標記探針的方法及檢測方法也各異。下面僅就國際上較常用的，有實用價值或發展前景的幾種核酸標記方法及其顯示方法分兩方面簡述如下。

　　（一）核酸探針的常用酶促標記技術

　　1．缺口平移　該技術由Kelly等于1970年創立。其原理是首先用DNA酶在雙鏈DNA探針分子的一條鏈上制造一些缺口（nick ）,缺口處會形成3’—羥基末端，這時再在大腸桿菌DNA聚合酶I的催化下將核苷酸殘基加在3’－羥基上，同時，根據大腸桿菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性，此酶將缺口5’側核苷酸依次切除。其結果是在缺口平移（nick tr－anslation）。根據這個原理，如果用高強度的放射性核苷酸（通常為α-32PdATP）置換先前存在的核苷酸，則可制備比活性高達108cpm（每分鐘計數）/μg的32P標記DNA。用缺口平移法標記的DNA探針能滿足大多數雜交要求。

　　2．DNA快速末端標記　大腸桿菌DNA聚合酶i 經枯草桿菌蛋白酶切割可得到兩條多肽鏈，其中分子量為76kd的大片段稱為Klenow片段。該酶具有完整聚合酶I的5’→3’聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性，但缺乏5’→3’核酸外切酶活性。利用Klenow片段可以填補由限制酶消解DNA所產生的3’凹陷末端。因此，用這種方法可以標記雙鏈DNA的凹陷3’末端。用Klenow片段標記末端一般只用一種[α-32P]dNTP，加入反應的[α-32P]dNTP取決于DNA末端延伸的5’末端序列，例如，用Ecor I切割DNA所產生的末端用[α-32P]dNTP標記。標記反應可在一種限制酶消解DNA后立即進行，不需去除限制酶或使其失活，也不需更換緩沖液，具有3’延伸的DNA末端不能被Klenow片段有效在標記，欲標記這類分子可用T4DNA聚合酶。

　　選用這種標記方法是為了產生可用于凝膠電泳時作大小參照物的DNA片段。因為標記的DNA片段與其摩爾濃度成比例，而不與片段大小成比例，在限制酶消化物中，小的和大的片段都以相同程度被標記。因此，可使用放射自顯影術確定不有被溴化乙錠染色所觀察到的大小DNA帶，尤其適用于Southern吸印雜交時分子量標志物的標記。通過選擇相應標記的dNTP，該法還可以只標記DNA分子的一端。例如，若DNA片段的兩個末端分別是Bam H I和Hind III 粘膜端，在反應中只加入[α-32P]dNTP或[α-32P]dGTP，使可選擇性標記兩末端之一。

　　3．用T4多核苷酸激酶標記DNa 5’末端　寡核苷酸探針或短的RNA和DNA探針可選用此法標記，寡核苷酸探針一般多用這種標記。T4多核苷酸激酶（polynucleotide kinase, PNK）是由T4噬菌體感染的大腸桿菌中提取的，此酶能催化ATP的γ-磷酸轉移至DNA或RNA的5’－OH末端。在過量ADP存在時，也可促進磷酸交換反應，使PNK將DNA末端5’磷酸轉移到ADP上生成ATP，然后催化[α-32P]dNTP上的標記磷酸轉移至DNA的5’末端，從而使DNA重新磷酸化，并藉此得到標記。顯然，PNK標記DNA末端需要[γ-32P]dNTP，這與前述酶促標記方法不同。通常，對于5’磷酸化的DNA探針，要先用堿性磷酸酶去掉磷酸基團，然后再用于PNK催化的5’末端標記，這樣標記效率較高。

　　4．隨機引物延伸　這是以單鏈DNA或RNA模板合成高比活性32P標記探針所選用的方法。原理是使長6～8nt的寡核苷酸片段與變性的DNA或RNA模板退火，在DNA聚合酶I或反轉錄酶的作用下，以每一個退火到模板上的寡核苷酸片段為引物引發DNA鏈的合成，在反應時將[α-32P]dNTP摻入合成鏈，即得到標記。變性處理后，新合成鏈（探針片段）與模板解離，即得到無數各種大小的探針DNA。因為所用寡核苷酸片段很短，在低溫條件下可與模板DNA隨機發生退火反應，因此被稱為隨機引物（random primer）。這種隨機引物可用小牛胸腺DNA或魚精DNA制備。

　　用隨機引物法標記的DNA探針或cDNA探針比活性顯著高于缺口平移法，且結果較為穩定。這種方法尤其適用于真核DNA探針，因為隨機引物來自真核DNA，其與真核序列的退火率要高于原核序列。因此，對于克隆的DAN探針，常先將插入探針DNA切下來回收后再標記，而缺口平移法可直接用于全質粒的標記。

　　5．聚合酶鏈反應（詳見第二十二章）　聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）是一種分子生物學新技術，由美國Cetus公司人類遺傳學部的Kary.B. Mullis于1985年創立。該技術利用兩個與相反鏈雜交并隨著于靶DNA兩側的寡核苷酸引物經酶促合成特異的DNA片段，包括模板變性，引物退火和引物延伸三個步驟的反復循環，最終兩引物所夾靶DNA得到千萬倍以上的擴增。因此 ，PCR技術已成為一項極為有價值的技術并已迅速推廣應用。

　　PCR技術有許多重要用途，其中之一便是可用來標記高比活性DNA探針。PCR技術具有很高的特異性，可在1～2h之內在量合成探針DNA片段，如果在底物中加入[α-32P]dNTP或其它標記的dNTP，則探針DNA合成過程中可得到很好的標記，標記物的摻入率可高達70%～80%。因此，PCR標記技術特別適用于大規模檢測和非放射性標記。該法的缺點是要合成一對特異性PCR引物。使用從探針DNA上制備的小片段作引物也能取得較好的標記效果。

　　（二）核酸探針的非放射性標記技術

　　1．光敏生物素標記核酸　目前使用的光標生物素試劑有兩種：光生物素（乙酸鹽）和補骨脂素生物素。它們都是由一個光敏基團、一個連接臂和一個生物素基團組成。光生物素的光敏基團是-N3，它在光作用下可與核酸中的堿基結合。補骨脂素生物素中的光敏基團補骨脂素在光照（320～400μm）下，可與單鏈或雙鏈核酸發生反應，反應主要在T上，C上也有一定程度的反應。光敏生物素的連接臂含6～12個碳原子，用以減少探針雜交時的空間位阻。光敏生物素標記核酸，方法簡單，靈敏度也可達到pg水平，可用于外源基因的檢測。最近出現了一種新的光敏活性DNA生物素試劑，即生物素-聚乙二醇-當歸素（BPA）。BPA的DNA結合部分是一個活性糖香豆素衍生物，在長波UV下它可與DNA堿基共價鍵結合。BPA反應物與DNA結合比光敏生物素更特異，在可見光下它不與核酸反應，這個特性可使BPA只標記粗制細胞裂解物中的核酸，而不標記蛋白、多糖和其他細胞大分子。

　　2．酶促生物素標記核酸　以生物素化的脫氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio –7 – dATP、Bio-11-dCTP）等代替相應32P標記的脫氧核苷三磷酸，經DNA聚合酶作用摻入DNA。Bio-dUTP代替dTTP,Bio-dATP代替dATP，Bio- dCTP代替dCTP。Bio –11-dUTP的11是指生物素基團與脫氧核苷酸之間連接臂的碳鏈長度。常用的酶促生物素標記DNA的方法有缺口平移法和隨機引物延伸法。

　　3．寡核苷酸的生物素末端標記　有5’-磷酸的化學標記法和3’-OH的酶促標記法。前者將寡核苷酸的5’-磷酸接上一個乙二胺，然后用琥珀酰亞胺生物素，將生物素基團連接在磷酸酰胺基上。后者是用末端轉移將Bio-11–dUTP加于其3’-OH端（脫去一個焦磷酸）。

　　4．酶標DNA　標記試劑是辣根過氧化酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）。通過對苯醌（PBQ）與聚乙烯亞胺（PEI）連接而成（HRP-PBQ-PEI+），此試劑在戊二醛的作用下與變性的DNA結合，使HRP與DNA連接在一起，組成HRP標記的DNA探針。

　　5．酶標寡核苷酸　包括核苷酸5’末端標記HRP法和內部標記AP法。前者是在HRP中產生一個-HS反應基團，在寡核苷酸合成終了加在5’端，帶一個C6的-HS基，與活化的HRP反應生成5’-HRP寡核苷酸。后者是在全成寡核苷酸過程中將一個5’帶連接臂及CF3基團的尿苷3’亞磷酰亞胺合成在寡核苷酸鏈中，合成后此活化的寡核苷酸與AP反應即得到AP標記的寡核苷酸。

　　6．DNA半抗原標記　其原理與Bio-11-dTUP相同，只是用毛地黃甙代替生物素形成Dig –11- dUTP，酶促摻入DNA分子。用抗毛地黃甙抗體檢測標記在DNA上的半抗原分子Digoxigenin（地高辛）

　　(三）非放射性探針的顯示體系

　　1．AP顯色體系

　　BCI –OH+NBT→紫色↓

　　ASO：等位基因特異的寡核苷酸，BCIP：5溴-4氯-3吲哚磷酸，NBT：四氮唑藍，Pi：磷酸。

　　2．HRP顯色體系

　　HRP + H2O2[HRP·H2O2]

　　ODA –NH2 +[HRP ·H2O2]棗→ODA-N = ODA/棕色↓+HRP +H2O

　　ODA：鄰-聯茴香胺。

　　3．ABC顯色體系

　　DNA –B + SA – AP→DNa – B – SA或DNa – B +SA - BAP→DNa –B –SA –BAP

　　經上述兩反應，把AP連接在DNA上以后，再進行AP酶顯色。這里SA為Streptavidin（鏈酶親合素），BAP為生物素化的磷酸酶，B為生物素（biotin），ABC為Avidin – Biotin - Enzyme com－plex, 即親合素- 生物素-酶復合物。

　　以上反應AP亦可用HRP代替。

表18-3曱核酸探針的標記分子

　　* ：NT：缺口平移； PCR：聚合酶鏈反應；RPL： 隨機引物標記； TL：末端標記

　　4．非放射發光自顯影　　若將AP或HRP的顯色底物根據光化學原理換成一種酶解后產生光子的化合物，可用自顯影技術暴光X線片顯示。

　　（1）HRP發光自顯影：氨基苯-甲酰肼在HRP與H2O2的作用下氧化為氨基苯二甲酸，同時放出N2及發光（波長428nm）。發光時加入某些酚的衍生物時可增強發光上千倍。反應如下圖：

　　（2）AP的發光自顯影：AP的發光底物是金剛烷二氧丁環磷酸鹽（AMPPD），它含有磷酸酯鍵在AP的作用下水解下一個磷酸，進而由分子內過氧鍵提供能源分解產生金剛酮和激發態的甲基間-氧苯甲酸陰離子，當此陰離子恢復到基態時發出光子。可用波拉黑白片（621型）直接暴光顯影。顯影信號強度比BCIP/NBP顯色法強兩上數量級。是很前景的顯示體系。

　　其發光反應的原理如下：

　　HRP的發光原理：

　　AP的發光原理：