分子診斷常用技術（一）

分子診斷技術即是利用分子生物學方法對人類及病原體的各類遺傳物質進行檢測，以幫助對疾病進行診斷。以技術原理出發對分子診斷技術進行歸類與評價，以對目前臨床常用技術的沿革進行回顧。

1961 年Hall 建立的液相分子雜交法標志著人類掌握分子生物學技術對特定核酸序列進行檢測，開啟了對疾病分子診斷的大門。1983 年Mullis提出的聚合酶鏈反應( PCR) 概念，更是給分子診斷技術插上了基因擴增的翅膀，大大提高了基因檢測技術的敏感度與特異性，降低了分子診斷的技術門檻。按照檢測的原理對半個世紀中臨床常用的分子診斷方法進行歸類，以分子雜交、核酸序列測定、分子構象變異與定量PCR 4大類對其歷史沿革、技術原理與實踐應用進行簡要的介紹與評論，以更好的回顧過去，展望分子診斷領域的未來。

一、基于分子雜交的分子診斷技術

上世紀60 年代至80 年代是分子雜交技術發展最為迅猛的20 年，由于當時尚無法對樣本中靶基因進行人為擴增，人們只能通過已知基因序列的探針對靶序列進行捕獲檢測。其中液相和固相雜交基礎理論、探針固定包被技術與cDNA 探針人工合成的出現，為基于分子雜交的體外診斷方法進行了最初的技術儲備。

( 一) DNA 印跡技術( Southernblot)

Southern于1975 年發明了DNA 印跡技術，通過限制性內切酶將DNA 片段化，再以凝膠電泳將長度不等的DNA 片段進行分離，通過虹吸或電壓轉印至醋酸纖維膜上，再使膜上的DNA 變性與核素標記的寡核苷酸探針進行分子雜交，經洗脫后以放射自顯影鑒別待測的DNA 片段-探針間的同源序列。這一方法由于同時具備DNA 片段酶切與分子探針雜交，保證了檢測的特異性。因此，一經推出后便成為探針雜交領域最為經典的分子檢測方法，廣為運用于各種基因突變，如缺失、插入、易位等，及與限制性酶切片段長度多態性( restriction fragmentlength polymorphism，RFLP) 的鑒定中。Alwine 等于1977 年推出基于轉印雜交的Northern blot 技術也同樣成為當時檢測RNA的金標準。

( 二) ASO 反向斑點雜交(allele-specific oligonucleotide reverse dot blot，ASO-RDB)

使用核酸印跡技術進行核酸序列的雜交檢測具有極高的特異性，但存在操作極為繁瑣，檢測時間長的缺點。1980 年建立的樣本斑點點樣固定技術則擺脫了傳統DNA 印跡需要通過凝膠分離技術進行樣本固定的缺點。通過在質粒載體導入單堿基突變的方法，構建了首條等位基因特異性寡核苷酸探針( allele-specificoligonucleotide，ASO) ，更使對核酸序列點突變的檢測成為可能。1986 年，Saiki首次將PCR 的高靈敏度與ASO斑點雜交的高特異性結合起來，實現了利用ASO探針對特定基因多態性進行分型。其后為了完成對同一樣本的多個分子標記進行高通量檢測，Saiki又發明了ASO-RDB，通過將生物素標記的特異性PCR 擴增產物與固定于膜上的探針雜交顯色，進行基因分型、基因突變的檢測。該法可將多種寡核苷酸探針固定于同一膜條上，只需通過1 次雜交反應，即可篩查待檢樣本DNA 的數十乃至數百種等位基因，具有操作簡單、快速的特點，一度成為基因突變檢測、基因分型與病原體篩選最為常用的技術。

( 三) 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)

FISH 源于以核素標記的原位雜交技術， 1977年Rudkin首次使用熒光素標記探針完成了原位雜交的嘗試。在上世紀80 ～ 90 年代，細胞遺傳學和非同位素標記技術的發展將FISH 推向臨床診斷的實踐應用。相比于其它僅針對核酸序列進行檢測的分子診斷技術，FISH 結合了探針的高度特異性與組織學定位的優勢，可檢測定位完整細胞或經分離的染色體中特定的正常或異常DNA序列; 由于使用高能量熒光素標記的DNA 探針，可實現多種熒光素標記同時檢測數個靶點。如今，FISH 已在染色體核型分析，基因擴增、基因重排、病原微生物鑒定等多方面中得到廣泛應用。通過比較基因組雜交( comparative genomic hybridization，CGH) 與光譜核型分析( spectral karyotyping，SKY) 等FISH 衍生技術，使其正在越來越多的臨床診斷領域中發揮作用。

(四) 多重連接探針擴增技術(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)

MLPA 技術于2002 年由Schouten 等首先報道。每個MLPA 探針包括2 個熒光標記的寡核苷酸片段，1個由化學合成，1個由M13 噬菌體衍生法制備; 每個探針都包括1 段引物序列和1 段特異性序列。在MLPA 反應中，2 個寡核苷酸片段都與靶序列進行雜交，再使用連接酶連接2 部分探針。連接反應高度特異，只有當2 個探針與靶序列完全雜交，連接酶才能將2 段探針連接成1 條完整的核酸單鏈; 反之，如果靶序列與探針序列不完全互補，即使只有1 個堿基的差別，就會導至雜交不完全，使連接反應無法進行。連接反應完成后，用1 對熒光標記的通用引物擴增連接好的探針，每個探針擴增產物的長度都是唯一的。最后，通過毛細管電泳分離擴增產物，便可對把核酸序列進行檢測。由于巧妙地借鑒了擴增探針的原理，MLPA 技術最多可在1 次反應中對45 個靶序列的拷貝數進行鑒定。

該技術具備探針連接反應的特異性與多重擴增探針雜交的高通量特性。經過MRC-Holland 公司10 余年的發展，MLPA 技術已成為涵蓋各種遺傳性疾病診斷、藥物基因學多遺傳位點鑒定、腫瘤相關基因突變譜篩查、DNA 甲基化程度定量等綜合分子診斷體系，是目前臨床最為常用的高通量對已知序列變異、基因拷貝數變異進行檢測的方法。