分泌肽能系統干擾中的蛋白質組學分析實驗

一、材料

1 細胞培養和裂解

（1）小鼠腦垂體 AtT20 和 AtT20 (proSAAS) 細胞系。 AtT20 .(proSAAS) 細胞系通過用包含一個新霉素抗性基因的 proSAAS 表達載體轉染 AtT2 0 細胞，再利用該基因對細胞毒性藥物 G4 1 8 的抗性挑選陽性細胞得到（11)。

（2）含有 1 0 % 胎 牛 血 清（Wisent Inc. ， Quebec, Canada) 和 30 pg/m L 硫酸雙生霉素的 DMEM 培 養 基（Gibco/BLR, Grandlsland, N Y)，含或不含 500 pg/mL的 G418 (Gibco/BLR)。

（3）磷 酸 鹽 緩 沖 鹽 溶 液（PBS): 1. 35 mol/L 的 NaCU 28 mmol/L 的 KC1， 80mmol/L 的 Na2 HPO4 ? 7 H20 ， 15 mmol/L 的 KH2PO4， pH 7. 2。

（4）Versine: 含 0.I mmol/L EDTA 的 PBS。

（5）緩 沖 液 B: 10 mmol/L 羥 乙 基 哌 嗪 乙 磺 酸（HEPES) -KOH， pH 7.4， 10mmol/L KC1, I.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol,』L EGTA 鈉 ， I mmol/L 二硫蘇
糖 醇（DTT)。

（6）蛋 白 酶 抑 制 劑（ PIC) 片 劑（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany): 一片 溶 于 10 m L 緩 沖 液 B

（7）Corning 細 胞 刮 刀（Sigma-Aldrich, St Louise, MO)。

（8）注 射 器（3 mL) 和 針 頭（2 6 目）。

（9） 蛋白質濃度測定試劑盒（Bio-Rad, Hercules, CA)。

2 雙向凝膠電泳

（1）IPGphor 膠條槽， 18 cm (AmershamBiosciences, Piscataway, NJ)。

（2）IPGphor 等電聚焦系統（Amersham Biosciences)。

（3）Hoeffer DALT 電泳系統（Amersham Biosciences)。

（4） pH 4?7L 的固相 pH 梯 度（IPG) 膠條， 18 cm (Amersham Biosciences， Uppsala， Sweden)。 保存于一 20°C 。

（5）水 化 上 樣 緩 沖 液（RB) : 7 m o l/L 尿 素 ， 2 m o l/L 硫 脲 ， 4 % CHAPS,1 % DTT

（6）BiaLyte 3/10 兩性電解質（Bio^Rad)。保存于 4°C 。

（7）礦 物 油（Bio——Rad)。

（8）IPG 膠條平衡緩沖液（EBl): 50 mmol/LTris-HCl， pH 8.8, 6 mol/L 尿素，30% (V/V) 甘油， 2 % 十二烷基磺酸鈉（SDS)， 1 % DTT, 1X 10-4% 溴酚藍。

（9）IPG 膠條平衡緩沖液（EB2): 50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.8, 6 mol/L 尿素，3 0 % (V/V ) 甘油， 2 % SDS， 4 % 碘乙酰胺， 1X 10-4% 溴酚藍。

（10） 甲叉雙丙烯酰胺溶液（30_8%T ) (神經毒，戴手套!）： 3 0 % 丙烯酰胺， 0.8%
甲叉丙烯酰胺。保存于 4°C 。

（11）1 0 % SDS。

（12）1 0 % 過硫酸胺。

（13） 四甲基乙二胺（TEMED， BitRad)。

（14） SDS 電泳緩沖液： 25 mmol/L Tris, 192 mmol/L 甘氨酸， 0.1% SDS。

（15）低熔點瓊脂糖（LMT) (Gibco/BLR)。通過微波爐加熱溶解 1 % L M T 至 SDS電泳緩沖液中。在使用前保持 50°C 。

（16）銀染溶液：a固定液： 3 0 % 乙醇， 5 % 乙酸；b 敏化液： 0.02% 硫代硫酸鈉；c銀染試劑： 0 . 2 % 硝酸銀。d 顯影液： 4 % 碳酸鉀， 0.025% 甲醛(37%); e 停顯試劑： 4 % Tris 堿 ， 2 % 乙酸。

（17）Umax Powerlook 1100 掃 描 儀（Umax Technologies, Dallas, TX)。

3 基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOFMS)

（1）胰蛋 白 酶（cat.no. V5111， Promega, Madison， WI)。

（2）ZipTip (：18 移 液 吸 頭（Millipore， Bedford, MA)。

（3） 基質溶液： 10 m g/m L 的 a-氰-4-羥基肉桂酸溶于含〇.1% 三氟乙酸的 50% 乙腈。

（4）Voyager DETm-P R O 基 質 輔 助 激 光 解 吸 電 離 - 飛 行 時 間 質 譜（MALDI-TOF)(PerSeptive Biosystems, Framingham, MA)。

（5）MALDI 板（PerSeptive Biosystems， Framingham, MA)。

4 免疫印跡

（1） 硝酸纖維素膜（Bio-Rad)。

（2）Towbin 緩沖液： 25 mmol/L Tris, 192 mmol/L 甘氨酸， 0.1% SDS， 2 0 % (V/V) 甲醇。

（3）IX T ris 緩 沖 鹽 溶 液（1XTBS): 10 mmol/L Tris-. HCl， pH 8_0， 150 mmol/L NaCl

（4） TBS——T : I X TBS, 0.1% Tween-20。

（5）5 % 脫脂牛奶溶液： TBS^T , 5 % 脫脂牛奶。

（6）ECL? 抗兔抗體，辣根過氧化物酶鏈接的 F Ub’)2 片 段（來自驢）（ AmershamBiosciences)?

（7）Western Lightning 化學發光試劑（PerkinElmer, Boston, MA)。

二、方法

1 樣本制備

（1）將 AtT2 0 和 AtT20 (proSAAS) 細 胞 用 150 m m 的 培 養 皿 培 養（每 種 細 胞 3盤），加 人 DMEM，在 37°C ， 5 % C0 2- 9 5 % 空 氣 的 潤 濕 環 境 中 生 長 至 滿 。AtT20 (proSAAS) 的培養基添加了 500fxg/mL 的 G418。

（2）每次用 10 m L 的 PBS 漂洗單層細胞 3 次。

（3）用 Versine 覆蓋細胞；用細胞刮刀將細胞從板上刮下，將細胞懸液轉移到離心管中。

（4）4°C 1300 g 離心 5 min 沉淀細胞。移出并丟棄上清液。

（5）如上所述再次離心來移去殘留的 Versine。

（6）用 0.5 mL 的含 PIC 的緩沖液 B 重懸細胞，用帶有 2 6 目針頭的注射器推拉 3 0 次來破裂細胞。

（7）將裂解產物 4°C , IOOOg 離 心 7 min。將上清液轉移到新管子中并丟棄沉淀。

（8） 4°C 下 l 〇 V 離心上清 30 min，將 上 清 液（細胞質成分）轉移到新的管子中并保
留 沉 淀（微粒體成分)。

（9）加 3 倍體積的丙酮到每份細胞質成分中并置于一 20°C lh ，沉淀蛋白質。 4°C 下15 800 g離 心 15min 。棄去上清液，保留沉淀。

（10）用超聲處理法將每份細胞質沉淀或微粒體蛋白溶于 500 的 R B 中（見注釋1)

（11）使用 Bio——Rad 蛋白質濃度測定試劑盒， Bradford 法確定蛋白質濃度。

2 雙向電泳

2.1 等 電 聚 焦（IEF)

2.2 十 二 烷 基 磺 酸 鈉 - 聚 丙 烯 酰 胺 凝 肢 電 泳（SDS^P A G E )

3 銀 染（19)

3.1 銀 染（見 注 釋 7)

以下步驟在振蕩中進行。
(1)將凝膠浸在固定液中 30 min。

(2)更換固定液再振蕩 30 min。

(3)用水漂洗凝膠 5 次 ，每 次 5 min。

(4)在敏化液中孵育凝膠 lmin。

(5)用水漂洗凝膠 2 次 ，每 次 lmin。

(6)在銀染試劑中孵育凝膠 30 min。

(7)用水漂洗凝膠 2 次 ，每 次 lmin。

（8）在顯影液中孵育凝膠直到蛋白質斑點出現。

（9）用停顯試劑終止顯影 30 min。

（10） 用水漂洗凝膠 3 次，每 次 5 min。

3.2 2D 圖像獲取

銀染凝膠在 Umax Powerlook 1100 掃 描 儀（圖 1 ) 上掃描，保存數子圖像。

4 銀染膠脫色 （20)

（1）切取感興趣的凝膠斑點。

（2）按 1 : 1 的比例混合 30 mmol/L 的鐵氰化鉀和 100 mmol/L 的硫代硫酸納。

（3） 用 100 uL 以上溶液覆蓋凝膠片。

（4） 室溫下振蕩直到銀染去除。

（5） 每次用 500 uL 水漂洗凝膠片，并更換水數次直到黃色試劑去除。

（6） 在 200 uL 200 mmol/L 的碳酸氫氨中孵育凝膠片 20 min 并振蕩。

（7）用 500 水漂洗凝膠片 2 次 ，每 次 lmin。

（8）離心并除去水。

5 胰 酶 消 化 （21， 22)

(1)將凝膠片在 200 uL CH3CN 中孵育 10 min。

(2)離心并除去 CH3CN。

(3)SpeedVac 真空離心蒸發濃縮凝膠片 15 min。

(4)56°C 下在 100 )nL 100 mmol/L NH4 HCO3, 10 mmol/L DTT 中孵育凝膠片45 min

(5)離心并除去 D T T 溶液

(6)加 100 100 mmol/L NH4 HCO3， 55 mpol/L 碘乙酰胺，并在室溫下黑暗中孵 育 30 min。

(7） 離心并除去碘乙酰胺溶液。

(8)在 100 100 mmol/L NH4 HCO3 中振蕩漂洗凝膠片 lOmin。

(9) 離心并除去 NH4 HCCV 溶液。

(10) 室溫下在 100 pL CH3C N 中脫水凝膠片 5 min。

(11) 離心并除去 CH3CN

(12)在 100 uL 100 mmol/L NH4 HCO3 中振蕩漂洗凝膠片 5 min。

(13)離心并除去 NH4 HCO3 溶液。

(14)室溫下在 100 uL CH3CN 中脫水凝膠片 5 min。

(15)離心并除去 CH3CN。

(16)SpeedVac 真空離心蒸發濃縮凝膠片 15 min。

(17)在冰上用 20 含 500 ng 胰酶的 50 mmol/L NH4 HCO3 泡脹凝膠片 30 min。

(18)去除殘留的胰酶溶液，并 加 50 mmol/L 無胰酶的 NH4 HCO3 覆蓋凝膠片。

(19)37°C 下消化凝膠中的蛋白質過夜。

(20)離心并將上清轉移到新會子中。

(21)加 50 uL 50% C H 3 C N , 0 . 1 % 三氟乙酸到凝膠片上并在冷水浴中超聲處理 3 min。

(22)離心并轉移上清到最初的上清中。

(23)再重復步驟 2 1 和 22 兩次。

(24）SpeedVac 真空離心蒸發濃縮上清液直到體積小于 10 uL。

(25）加0 . 1 % 三 氟 乙酸至 10 uL 。

6 胰蛋白酶肽段 MALDI-TOF 質譜分析

（1）在 MALDI-TO F 分析之前，按照制造商說明書用 ZipTip C18 移液吸頭純化胰蛋白酶消化的肽段。

（2）將純化的肽段用 2 uL 基質點在 M A L D I 板上。

（3）用以下儀器設定采用延遲提取和反射模式進行質譜分析： 20 k V 加速電壓， 150ns 延遲時間， 7 0 % 柵極電壓， 0.05% 導向線電壓， 128 激光發射，激光強度2000, 質量門從 800 到 2800。m/z 842. 5 1 和 m/z 1045. 5 6 的胰酶自降解產物用于 內部質量校準（圖 2)。

（4）選擇單同位素峰的質量，通過使用搜索引擎 PeptIdent (http://www.expasy.ch/tools/peptident.html) 搜索 Swiss-Prot 和 TrEMBL 數據庫，與相應理論質量匹配在 50 ppm? 之內來鑒定蛋白質。

7 2D 免疫印跡

（1）如 3. 2 所述重復制備 2D 凝膠。

（2）根據制造商用戶手冊，在 含 Towbm 緩沖液的 Hoefer SE 600 槽中將蛋白質點從未染色的凝膠上轉移到硝酸纖維素膜上。

（3）用 5% 脫脂牛奶溶液封閉膜。

（4）室溫下將膜在含抗-EphA2 —抗 的 5 ? 脫脂牛奶中孵育 lh 。

（5）在 TBS”T 中漂洗膜 4 次 ，每 次 5 min。

（6） 在 含 HRP-結合的驢抗兔 IgG 的抗體的脫脂牛奶溶液中孵育膜 lh 。

（7）在 T B S T 中漂洗膜 4 次，每 次 5 min。

（8） 根據制造商方案，用 Western Lightning 化學發光試劑顯示免疫反應斑點（圖3)。

（1） 樣品蛋白的完全增溶、去解聚、變性和還原是用 2D 凝膠分離蛋白質能否成功的關鍵。因此，蛋白質沉淀需在 R B 中用超聲處理至少 3 min 以溶解。因為尿素在較高溫度下可以降解為異腈酸鹽，導致蛋白質氨甲基化，所以超聲處理在冰水浴冷卻下用 cuphorn 超聲儀進行。

（2）IPG 膠條槽是用陶瓷制成的，使用時小心。

（3）為了避免污染，帶手套工作。不要讓 IPG 膠條下存留氣泡。

（4） 這 里 用 來 制 備 溶 液 的 水 必 須 擁 有 以 上 的 電 阻 率 。

（5）20 cm 長帶蓋子的玻璃管用于平衡很理想。

（6）避免在 IPG 膠條和 SDS 膠之間存留氣泡。

（7）銀染是最敏感的可視化方法。為得到高質量的結果，應使用高純度的試劑并戴手套以避免污染。