方群：單細胞蛋白質組學二十年夢想成真

　　由于無法對蛋白實現擴增，因此在單細胞多組學的研究中，單細胞蛋白質組學是最具挑戰的研究，近年來已取得突飛猛進的進展。除了質譜儀檢測靈敏度的提升，在前端取樣、預處理和分離方面的巨大進步是重要因素，這和微流控技術的進步密不可分。中國的研究者研制出具有自主知識產權的單細胞蛋白質組微操控儀，在這條前沿賽道上處于國際先進水平。近日，分析測試百科網專訪了浙江大學求是特聘教授、化學系微分析系統研究所所長、浙江大學杭州國際科創中心單細胞蛋白質組研究中心主任方群教授，他在2024年創立了杭州弘微新譜科技有限公司，并發布 Celleagle 賽鷹微流控單細胞操控儀。方群教授將分享自己20余年來在單細胞蛋白質組學方面的科研歷程，以及產業化背后的思考與展望。

浙江大學 方群教授

單細胞蛋白質組學的最初嘗試

　　自1998年研究生時期起，方群教授就踏入了微流控芯片研究領域，1999年底被引進到浙江大學化學系微分析系統研究所工作。2004年，復旦大學的楊芃原教授與浙江大學的方肇倫院士合作，最早提出開展微流控單細胞蛋白質組分析——集成化單細胞蛋白質組研究微流控芯片系統。

　　方群教授回憶道：“我們在實驗室的搬遷整理舊資料時，偶然發現了這份 2004 年的合作協議。當時，兩家單位在沒有任何資助的條件下開始合作，后來在2005年一個973項目中獲得了一項2.4萬的子課題項目資助。”

　　當時，常規的蛋白質組學分析需要幾萬個細胞做一次測定；開展單細胞蛋白質組學研究，無論是微流控技術還是質譜的靈敏度都受到很大限制，兩年的嘗試下來，試驗沒有獲得很好的結果。方群教授的研究方向又重新回到微流控技術。

發明SODA

　　方群教授回憶道：“我們做了十年的微流控研究，2009-2010 年時，我們開始反思自己的研究：雖然發表了很多高質量的文章，也做了很多創新性的工作，但總覺得還缺少一些實際應用的落地。”這時，斯坦福大學的Stephen Quake教授訪問浙江大學，他的研究方向從微流控技術轉向了單細胞測序。方群教授從他的經歷中得到了啟發：“Quake教授做微流控研究的初衷是為了找到一個合適的生物醫學工具，當他找到這個工具后，就轉向了實際應用。這讓我意識到，我們不能僅僅停留在發表文章上，還需要將微流控技術真正推向實際應用。”

　　要實現微流控芯片的廣泛應用，必須要解決芯片的通用性和靈活性問題。“很多微流控芯片的特點是千人千面，比較個性化，為不同的應用需設計不同的芯片，因此，芯片常常沒有通用性，沒有普適性。”方群說，“微流控的核心在于微流體的操控，如果將這個關鍵核心抽提出來，形成微流控方法的創新，就有可能實現通用性的應用。”

　　2013年，方群團隊研發出序控液滴陣列技術技術（Sequential Operation Droplet Array, SODA)。SODA系統能夠通過吸-點-移三個單元操作的靈活組合，在皮升精度水平自動化地完成多步復雜的液滴操控，包括液滴生成、轉移、融合、分裂、尋址、分選等。“簡單來說，SODA通過移動平移臺，靠近樣品時用一根毛細管吸取納升到皮升級微量的液體，然后推出液滴，并在液滴上面蓋油防止其蒸發。這樣，SODA就形成一個非常微小的化學反應器。順序進行取液，反應，再取液再反應，即能實現復雜多步的微反應。”SODA系統的獨特之處在于其高度的靈活性、通用性和兼容性，能夠適應多種應用場景。經過多年的優化和改進，SODA系統逐漸成型，并在單細胞分析、高通量篩選、現場分析等領域展現出巨大的潛力。

SODA迭代升級：單細胞蛋白質組學研究利器

　　2014 年，方群團隊與上海國家蛋白質科學中心的雷鳴研究員合作，用SODA進行蛋白結晶條件的篩選，機緣巧合認識了黃超蘭研究員。黃超蘭研究員曾在美國斯克里普斯研究所從事博士后研究工作，師從John Yates 教授，對質譜和蛋白質組學研究有非常豐富的經驗。雙方一拍即合，決定再次挑戰單細胞蛋白質組學研究。

　　合作中，黃超蘭研究員展示了常規蛋白質組學的樣品處理過程，包括細胞破膜、還原烷基化、酶解等至少 7 步操作，最多可達 7 步到 11 步。SODA系統的特長在于進行復雜多步微反應，很適合完成上述操作。但如何防止如此微小的液滴在操作過程中的蒸發損失？為此，團隊設計了一種原位液滴反應器，將納升級液滴固定在原位進行反應，并在液滴上方隔著空氣覆蓋一層油以防止蒸發，構成了納升級油-氣-液滴（OAD）芯片。同時，他們還針對單細胞蛋白質組分析的各個流程進行了優化。

　　經過四年的艱苦努力，2018年，雙方合作首次實現了哺乳動物體細胞的單細胞蛋白質組分析，并在《Analytical Chemistry》上發表了這一突破性成果^【1】。

　　“當時許多人都覺得單細胞蛋白質組學不可能實現。因為2004年我們自己挑戰失敗過；而2014年幾萬個細胞才能鑒定數千種蛋白質。”方群回顧說，“非常感謝黃老師的合作和鼓勵，感謝我的博士生李紫藝堅持了4年，我本人可能屬于‘無知者無畏‘，更多考慮地是如何減少單細胞樣品在這些多步復雜前處理過程中的樣品損失。多年的微流控研究經驗告訴我們，微流控系統有顯著的尺度效應，其中之一是當系統尺度減小10倍后其比表面積增大10倍，會導致管路的吸附效應遠大于常規體系。我一直有個猜想，之前單細胞蛋白質組分析不成功，也可能并不完全是質譜儀的靈敏度不夠，也有可能是在復雜多步的蛋白質組樣品預處理中，極其微量的單細胞樣品被損失掉了。基于這種考慮，我們沒有采用常見的微流控芯片流動通道的模式，而是設計了基于SODA技術的原位液滴反應器配合基于毛細管探針的液體操控系統，包裹單細胞的液滴一直不動，利用毛細管探針在原位進行多步反應，其后再用氣壓將反應后的液滴推進毛細管液相色譜柱，進行液質聯用分析。”

用于單細胞蛋白質組分析的樣品前處理和進樣的流程圖

　　這種微型化的油-氣-液（OAD）芯片及相應的納升級液體操控和進樣方法，能夠在原位靜態的納升級液滴中完成多步樣品前處理，并將液滴樣品直接高效地注入到色譜分析柱內完成后續的LC-MS分離檢測。通過采用優化后的實驗條件，該系統成功地從1個HeLa細胞內鑒定出51種蛋白質。

　　“在單個鼠卵細胞的蛋白質組分析中，我們對比了OAD芯片與常規離心管做反應器的結果，離心管最多鑒定30種蛋白質，而OAD芯片可鑒定355種蛋白質。這證明了單細胞蛋白質組學的主要挑戰來自于樣品前處理的損失。實驗結果給了我們很大的鼓舞。”方群說。

　　“基于上述結果，我們申請并獲得了國家重大儀器研究研制項目（基于微流控液滴技術的自動化、多模式單細胞分析系統的研制）的支持，自主研發了四臺三代應用于單細胞蛋白質組分析的SODA系統，在2024年結題時被評為“優秀”。

　　方群研究組在浙江大學繼續優化SODA系統，采用商品化內插管替代OAD芯片作為納升級微反應器，以方便操作和直接兼容LC-MS系統的自動進樣器。該系統采用“所見即所得”的操作方式，借助顯微鏡確定目標細胞后進行原位單細胞挑選，再進行多步的樣品預處理反應，將最終酶解后的多肽移入進樣瓶，進行液質聯用分析。配合浙江大學實驗室購買的高靈敏度質譜儀，團隊對單細胞蛋白質組學的5大關鍵流程進行優化，包括：細胞捕獲、樣品前處理、色譜分離、質譜檢測、數據處理，最后發展出“點取式”單細胞蛋白質組分析流程（PiSPA），首次在單個哺乳動物細胞中實現了高達3000種蛋白質的超高定量深度，研究成果在2024年《Nature Communication》上發表^【2】。

“點取式”單細胞蛋白質組分析流程示意圖

　　關于為何從微流控轉向單細胞蛋白質組研究，方群談到兩點原因。首先，從人類認識世界的角度看，在單細胞水平上去認識細胞功能的實際執行者——蛋白質是必須經過的一個階段。其次，從單細胞轉錄組技術的發展可預知單細胞蛋白質組技術的未來。2009年人們第一次獲得單細胞轉錄組的結果，2012年獲得12%的測序深度，2015-2016年，由于微流控液滴技術和核酸編碼技術的引入，使得幾千上萬個單細胞樣品的轉錄組高通量測序成為可能。其后，單細胞轉錄組研究呈現爆發式發展，年發表文獻已超過3,000篇。單細胞蛋白質組研究在2018年實現了方法的突破。近兩年，單細胞蛋白組分析已經達到了13%-20%鑒定深度，已經達到10年前單細胞轉錄組測序技術的相近水平。類比單細胞轉錄組測序技術的發展歷史，可以預見當前已處于單細胞蛋白質組分析技術的爆發階段。方群說到：“這是我做產業化的初衷。而且從認識論角度說，蛋白質是生物功能的實際執行者，和生物功能更直接相關；由于翻譯過程中影響因素眾多，從轉錄組數據往往并不能直接推導出蛋白質組的結果。因此，人類必然要在單細胞層面認識蛋白質組，這應該是生物醫學專家們更需要了解的結果。”

產業化之路：從實驗室到市場

　　2024 年，方群教授創立了杭州弘微新譜科技有限公司，并發布了 Celleagle 賽鷹微流控單細胞操控儀。針對單細胞分析，可以提供一套包含自動化單細胞精準分選與捕獲、樣品預處理、蛋白質組學分析在內的完整解決方案。

Celleagle賽鷹 微流控單細胞操控儀

　　賽鷹單細胞操控儀采用細胞成像與探針操控結合的方式進行單細胞的分選-捕獲操作，與市場上其它儀器相比，對目標細胞捕獲的指向性、確定性和可靠性均很高，還可以把細胞樣品的明場表觀形態、熒光成像、運動行為、空間位置等多維信息與深度的蛋白質組信息整合起來，開展更加深入的分析和研究。利用賽鷹單細胞操控儀，方群團隊通過觀察細胞遷移距離的差異，并對不同遷移行為的細胞進行單細胞蛋白質組分析，再比較其蛋白質水平上的差異。最近他們的一項研究發現了腫瘤細胞的耐藥異質性規律。當用藥物刺激腫瘤細胞時，雖然90%的腫瘤細胞會被殺死，但仍有一些細胞會存活。將每個存活的單細胞挑出來，再做熒光成像和單細胞蛋白質組分析，發現了兩類存活細胞：一類是代謝降低的“冬眠”細胞，另一類是活性高且耐藥的細胞。對這些耐藥細胞的研究，有可能找到腫瘤復發和轉移的關鍵原因。

　　“現在的賽鷹系統針對單細胞蛋白質組學研究的高端客戶，比如科研單位、第三方實驗室，這些客戶更希望獲得的是全套解決方案。“方群表示，“我們可提供整體解決方案，包括儀器、探針、試劑盒、微反應器、恒溫孵育箱等，甚至自主研發的高性能色譜柱。還大大簡化了樣品前處理操作，客戶只需要進行一步樣品前處理操作，就可獲得穩定的深度覆蓋的單細胞蛋白質組分析結果。我們還希望推動建立單細胞蛋白質組領域的生態圈，吸引更多研究者使用這一技術，使它像單細胞轉錄組技術那樣得到廣泛的普及并在生物醫學的研究和應用中起到重要作用。我希望我們的儀器能夠在這方面起到一些促進作用。“

　　利用賽鷹單細胞操控儀，方群團隊還與浙江大學良渚實驗室、浙江大學附屬第二醫院、邵逸夫醫院、婦產科醫院、浙江省腫瘤醫院等多家單位建立了合作關系，開展肺癌細胞、乳腺癌細胞、肝癌細胞、鼠卵細胞、干細胞等各類樣品的單細胞蛋白質組學研究。比如近期發表在《Advanced Science》^【3】上的研究可實現單細胞的靶向配對及互作研究，對免疫細胞與癌細胞的相互作用進行了深入探討。

　　最后方群表示：團隊將進一步提高單細胞蛋白質組分析的鑒定深度和通量，以持續推進該技術的實用化水平。我們還將與生物醫學專家們合作，拓展該技術在生物學、醫學和藥學等領域的深度應用，推動單細胞蛋白質組學技術的快速發展和應用普及。

　　【參考文獻】

　　1.Z-Y. Li, M. Huang, X-K. Wang, Y. Zhu, J-S. Li, C. C. L. Wong*, Q. Fang*, Nanoliter-scale oil-air-droplet chip-based single cell proteomic analysis, Anal. Chem., 2018, 90, 5430-5438. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.8b00661

　　2.Y. Wang, Z-Y. Guan, S-W. Shi, Y-R. Jiang, J. Zhang, Y. Yang, Q. Wu, J. Wu, J-B. Chen, W-X. Ying, Q-Q. Xu, Q-X. Fan, H-F. Wang, L. Zhou, J. Fang J-Z. Pan, Q. Fang*, Pick-up single-cell proteomic analysis for quantifying up to 3000 proteins in a Mammalian cell. Yu Wang,

　　Qun Fang. Nat. Commun., 2024, 15, 1279. https://doi.org/10.1038/s41467-024-45659-4

　　3.Q-Q. Xu, Y-R. Jiang, J-B. Chen, J. Wu, Y-X. Chen, Q-X. Fan, H-F. Wang, Y. Yang*, J-Z. Pan*, Q. Fang*, Single cell-pair proteomics for decoding immune-cancer cell interactions. Adv. Sci. 2025, 2414769. https://doi.org/10.1002/advs.202414769