劉志勇研究組在耳蝸螺旋神經節轉錄組分析研究獲進展

　　1月23日，eLife 期刊在線發表了中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心/神經科學研究所、上海腦科學與類腦研究中心、神經科學國家重點實驗室劉志勇研究組題為《耳蝸螺旋神經節在多個發育節點的深度轉錄組分析》的研究論文。

　　小鼠和人類的聽覺系統在發育和功能上十分相似。耳蝸螺旋神經節負責把外周的聲音信息（時間、強度和頻率等）傳遞到腦干的耳蝸核，隨后經腦干上橄欖核團、下丘、丘腦等最終到達聽覺皮層。耳蝸螺旋神經節功能非常重要，臨床上耳聾患者佩戴人工耳蝸的治療效果很大程度上取決于耳蝸螺旋神經節是否具有功能。因此如何保持耳蝸螺旋神經節的功能以及如何在損傷后再生出有功能的螺旋神經節是聽覺領域的一個重要且具有挑戰的研究方向。

　　為了找到研究的切入點，研究團隊首先致力于闡明兩個問題：1）耳蝸螺旋神經節在從胚胎早期到成年整個發育過程中，是否特異表達一些基因？2）這些特異的基因是否具有動態的變化特征，是瞬時表達（調節發育過程），還是永久表達（維持神經節的細胞命運）？為了準確地回答這2個核心問題，研究團隊利用轉基因小鼠的方法，在五個不同的發育時期（E15.5, P1, P8, P14和P30），特異在螺旋神經節內表達紅色熒光蛋白。然后通過組織消化、手工分選的方法獲得高純度、健康的螺旋神經節細胞。每個時間點分析三個重復，每個重復樣品包含100個左右螺旋神經節細胞。此方案能夠獲得高深度的全基因組表達譜，是之前10x單細胞轉錄組分析深度的5倍。基于此，該研究分析出了眾多之前未知的螺旋神經節表達特異、動態變化明顯的基因。

　　此外研究團隊選取了兩個特異基因Scrt2和Celf4，利用CRISPR/Cas9基因編輯系統構建了Scrt2-P2A-tdTomato和Celf4-3xHA-P2A-iCreER-T2A-EGFP兩種基因敲入模型，并在內耳進行了系統的分析，在單細胞層面確認了耳蝸螺旋神經節特異并高表達Scrt2和Celf4，進而佐證了論文中轉錄組測序數據的準確性和可靠性。新構建的小鼠模型對聽覺領域和腦神經科學領域（Scrt2和Celf4基因也在中樞系統高表達）的研究具有重要的應用價值。

　　該工作由腦智卓越中心聽覺系統發育再生研究組研究員劉志勇指導，博士后李超、李響、畢政鴻為共同第一作者，王廣琴，朱彤以及霍華德·休斯醫學研究所-詹寧斯研究中心Ken Sugino為此研究做出了貢獻。共聚焦成像相關工作在神經所所級中心的光學成像平臺完成，神經所楊輝研究組提供了顯微注射儀器，應文琴（楊輝組）在胚胎移植實驗中提供了幫助。該工作得到國家重點研發計劃、中科院戰略性先導科技專項、國家青年千人計劃、國家自然科學基金面上項目、上海市科技重大專項以及勃林格殷格翰公司專項支持。

圖注：(A) 圖示為手工分選耳蝸螺旋神經節的流程，在熒光體視顯微鏡下，將紅色熒光標記的螺旋神經節手工挑選并清洗三次后，轉移至裂解液中進行后續實驗；（B）熱圖顯示小鼠耳蝸發育過程中，21個特異性、持續高表達在螺旋神經節細胞中的基因；（C-D）圖為Scrt2-P2A-tdTomato小鼠（P1）耳蝸抗體Myosin VI（特異性標記毛細胞）和tdTomato 組織化學染色結果：組織鋪片免疫組化染色（C）和切片免疫組化染色（D）顯示Scrt2基因（tdTomato+）特異性高表達在耳蝸螺旋神經節中，毛細胞（Myosin VI+）中未見Scrt2基因表達，a:耳蝸頂圈；m：耳蝸中圈；b：耳蝸底圈；C圖和D圖中標尺為200 um