制備DNA測序模板實驗——小量裂解物中制備λ噬菌體DNA

重組λ噬菌體

DNA酶ⅠRNA酶ⅠPEGSMSDSEDTA異丙醇乙酸鈉TE

巴斯德吸管試管離心機

1.  在新鮮配制的λ頂層瓊脂糖和λ瓊脂糖平板上，通過在平板上裂解適于λ噬菌體生長的大腸桿菌菌株，制備重組λ噬菌體毒種原液。

2.  取700 μl 毒種液加入無菌的1.5 ml 微量離心管中，加入1 μl 1 mg/ml 的DNA酶Ⅰ及1 μl 1 mg/ml 熱處理過的RNA酶A，于37℃溫育30 min。

3.  加入700 μl λPEG溶液，冰浴放置1 h。

4.  4℃高速離心10 min，棄上清。再于4℃高速離心2 min，用拉細了的巴斯德吸管吸去殘余上清。

5.  重懸噬菌體沉淀于500 μl SM 培養液，加入55 μl 10%SDS，0.5 μl 0.5 mol/l EDTA，輕輕混勻，于65 ℃保溫15 min，不時輕輕搖勻溶解所有沉淀物。

6.  加入緩沖液平衡酚，用旋渦混合器劇烈振蕩來抽提。

7.  室溫高速離心2 min 將上層水相移入一個干凈微量離心管中，重復用500 μl 1：1酚/氯仿抽提，再重復用500 μl 氯仿抽提。

8.  加入50 μl 3 mol/l pH7.0乙酸鈉緩沖液，隨后加入550 μl 異丙醇，于-20℃冰凍30 min。

9.  于4 ℃高速離心15 min，吸出并棄上清，晾干DNA沉淀。

10.  重懸沉淀于50 μl pH8.0的TE緩沖液。

11.  用于測序時，在堿溶液中變性0.1~0.3 pmol DNA（2~4 μg）。