加州大學鐘聲團隊：用“一滴血”檢測胞外RNA液體活檢方法

　　細胞外RNA（exRNA）作為一種新型液體活檢標志物，因其廣譜性及多樣性近些年引起了科學家的廣泛關注。此前研究發現，包括miRNA在內的小exRNA與某些疾病的臨床治療反應相關，但關于其他類型exRNAs的存在情況及其臨床相關性研究仍十分有限。此外，血清中的exRNA經過提取步驟后，含量往往非常低，這無疑限制了研究人員對exRNA開展更為深入的研究。

　　為了高效分析血清exRNA，由加州大學圣地亞哥分校鐘聲教授領導的研究團隊（聯合H. Irene Su教授、錢煦教授）突破性地開發了一種名為“SILVER-seq”（Small Input Liquid Volume Extracellular RNA Sequencing）的低上樣量exRNA液體活檢技術，僅需單滴量級（5~7μL）的液體活檢樣本，便可對完整和碎片化的exRNA進行有效測序。利用SILVER-seq技術，研究人員發現，血清exRNA表達水平與供體性別和年齡之間呈現強相關性，并可通過血清exRNA對腦基因表達進行頻繁監測。此外，基于exRNA表達水平的分類還能有效區分乳腺癌患者與健康對照組，并進一步幫助區分復發與非復發乳腺癌患者。以上研究成果彰顯了基于單滴血清實現exRNA液體活檢的巨大潛力，為開發新型疾病篩查與監測手段指明了方向，也為探索疾病發生發展開辟了新視角。相關研究成果于當地時間9月3日在線發表于國際頂級學術期刊PNAS。

圖1：部分作者合影，從左到右為鐘聲、鄭海子、嚴章明、周子旭。

　　如上所述，SILVER-seq上樣量只需幾微升血清，該體積小于指尖采血的血量（約30μL）。為開發SILVER-seq技術，鐘聲教授研究團隊調整了單細胞RNA-seq的主要步驟。與其他液體活檢RNA-seq方法不同，為盡量減少血清中RNA的丟失，SILVER-seq并沒有從RNA提取純化開始，而是直接向原始樣本中添加試劑以進行盡可能多的生化反應。

　　那么SILVER-seq能否從微升級別的人體血清中穩定地構建測序文庫？

　　為此，研究人員利用同一血清樣本驗證了SILVER-seq技術的可靠性，最終獲得的測序文庫片段大小為200~500bp（圖2A），與預期文庫片段范圍大小一致。同時，研究人員還對8個文庫進行了測序，每個文庫平均產生480萬個單端測序reads，其中超過80％的reads都能唯一比對到人類基因組（hg38）（圖2B）。以上數據表明，SILVER-seq可以從幾微升的人類血清中穩定構建測序文庫。

圖2. SILVER-seq構建測序文庫，并與人類基因組（hg38）reads比對。圖片來源：PNAS文章。

　　此外，基于血清樣本，研究團隊對比了SILVER-seq與標準RNA-seq測序方法。結果顯示，經處理的5-7μL血清中exRNA的量約為10pg，與單個細胞中的RNA量相當。SILVER-seq檢測exRNAs的效率比標準RNA-seq更高，有效抑制了上樣量減少引起的檢測變化。

　　在分析試驗中，研究團隊利用SILVER-seq技術檢測了150多份血清液滴，這些樣本來自年齡18~48歲的乳腺癌患者和健康捐贈者。該研究分析了SILVER-seq檢測的exRNA濃度、片段長度和組織來源等信息，并在癌癥患者和健康人群中進行了exRNA檢測。

　　首先，研究人員檢測了10份人體血清樣本中的exRNA濃度和片段長度范圍，并使用了四種RNA純化試劑盒進行exRNA純化，包括exoRNeasy、TRIzol LS、NORGEN和QIAzol，然后用生物分析儀進行定量。研究結果顯示，這些血清樣本中的exRNA濃度范圍為0.3~4.2ng/mL，大多數exRNA長度在20~200個核苷酸（nt），表明SILVER-seq檢測到的是人體血清中的小RNA或片段化的長RNA。

圖3. 來自腦、外周神經系統和骨髓特定基因的exRNA數量和表達水平。圖片來源：PNAS文章。

　　分析發現，SILVER-seq可檢測到來自1/4以上人類基因的exRNA，包括小RNA、mRNA片段和長鏈非編碼RNA（lncRNAs），其中部分exRNA來自具有組織特異性表達的基因，例如大腦、外周神經系統和脊髓組織中的基因。此外，研究發現，根據exRNA表達可完全分離男性和女性樣本，并且exRNA表達與實際年齡相關（圖3）。

圖4. exRNA表達可區分癌癥和非癌癥樣本。圖片來源：PNAS文章。

　　值得注意的是，乳腺癌患者和健康人血清中的exRNA表達水平表現出顯著差異。即使不使用差異表達的exRNA作為指標，幾乎所有乳腺癌和健康對照樣本以及大部分復發和非復發乳腺癌樣本都可以通過exRNA表達進行正確分類（圖4）。 這表明了在單滴血清液滴中使用exRNA進行液體活檢診斷的臨床應用潛力。

　　文章共同通訊作者、加州大學H. Irene Su教授表示：“這種新型SILVER-seq技術可對來自微量人血清的exRNA進行測序。根據研究結果，SILVER-seq可以區分不同性別、年齡和乳腺癌狀態的樣本，有望用于人類疾病的微創篩查和監測。”

　　文章另一共同通訊作者、加州大學錢煦教授表示: “我們的微量體液測序技術（SILVER-seq）能夠從微量血液中檢測游離RNA，有極高的敏感性和可重復性。我們發現血液里的游離RNA可以確切反映個人的生理和病理狀態。這些臨床數據為用一滴血做體檢和疾病篩查及監測提供了重要的基礎。”

　　目前，已有多項研究結果顯示，exRNA為臨床疾病的治療提供指導和幫助。鐘聲教授團隊開發的SILVER-seq技術可利用微量血清中的exRNA診斷人類生理和疾病狀態，更容易用于臨床疾病的篩查和頻繁監測。同時，SILVER-seq可以發現血清中大量的長RNA片段，其中，部分RNA來自組織特異性基因以及癌癥相關基因。因此，在基于液體活檢的體外診斷研究中，exRNA可作為生物標志物用于疾病檢測和監測，甚至開發基于exRNA的治療手段。相信，隨著技術的完善，人們對exRNA的臨床意義和用途將會有更深的了解，這也將為實現多種疾病的臨床治療提供更加精準的信息。

　　同行專家點評

　　梁晗

　　MD安德森癌癥中心生物信息學與計算生物學系副系主任、普瑞基準聯合創始人

　　隨著精準醫學的發展， 液體活檢是當代醫學最活躍的領域之一，近年來各種新技術不斷涌現。在最新一期的《美國科學院通訊》（PNAS）上，美國加州大學圣地亞哥分校的鐘聲教授的團隊開發了一種基于一滴血清的細胞外RNA(extracelluar RNA) 檢測技術。文章顯示，這種技術可以檢測上萬基因的RNA表達，基于這些基因表達信息可有效地反映病人的年齡、性別等生理指標，并可進一步區分癌癥和正常樣本。此文所代表的重要臨床意義在于兩點：第一，因為所用血的量極少，對于疾病防治采樣的頻率可以大大增加而不會給檢測對象帶來太大的負擔；更重要的是，因為只需要一滴血，人們將不再需要到醫院等專門機構進行抽血，而是可能在家中和便利店等場所方便地進行。總之，這項激動人心的液體活檢技術突破為各種疾病的預防、診斷、監控和指導用藥的“常規化”和“大眾化”帶來了新的希望。

　　魯志

　　清華大學生命科學學院研究員

　　近日，UCSD的鐘聲教授團隊在國際權威雜志PNAS上發表了一種新型的體液RNA（exRNA：Extracellular RNAs）的測序方法，SILVER-seq（Small Input Liquid Volume Extracellular RNA Sequencing），可以從一小滴血清中直接對極微量的exRNA進行建庫測序。該方法克服了傳統的測序方法中體液起始量高的問題，其創新之處在于結合了EdgeSeq等體液建庫方法和TSO等高效建庫方法兩者的優點，做到了對血液量的體積要求比EdgeSeq（25ul血漿）更進一步降低（3～7ul血清），并能同時捕獲到小RNA和多種長RNA的片段（如mRNA、lncRNA等）。基于該方法，該研究對來自于96例乳腺癌和32例正常人的血清樣本進行SILVER-seq，檢測到了癌癥和組織特異性的exRNA，可以用來準確區分癌癥患者和正常人。此外，該研究結果還進一步確認了部分exRNA的表達在性別、年齡等不同人群中存在著一定的固有差異，這些exRNA的表達水平可以很好的衡量和預測性別和年齡（年齡預測準確性高達0.954）。總之，SILVER-seq技術為exRNA在液體活檢中的應用增添了又一個新的、高效的測序方法，其初步結果在更多樣本上進行交叉和泛化能力的檢測后，就可以在疾病早篩、病情監測和癌癥診斷上有很多很好的應用。

　　共同通訊作者簡介

H. Irene Su

　　H. Irene Su, Professor of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Science in the Division of Reproductive Endocrinology and Infertility at the University of California, San Diego. She is the the PI of the POISE (Predictors of Ovarian Insufficiency in Young Breast Cancer) Study, a prospective cohort study in young breast cancer patients examining pre-chemotherapy predictors of time to menopause, where more than 215 participants were recruited from three sites.

Shu Chien（錢煦）

　　Shu Chien, Professor of the University of California, San Diego，Director of Institute in Medicine at UC San Diego. His work on the fluid dynamics of blood flow has had a major impact on the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases such as atherosclerosis. Chien is currently President of the Biomedical Engineering Society and is one of only 11 scholars who are members of all three U.S. national institutes: the National Academy of Sciences, National Academy of Engineering, and the Institute of Medicine. He and professor Sheng Zhong jointly served as the director ofNIH Common Fund 4D Nucleome Organizational Hub.

鐘聲

　　鐘聲，加州大學圣地亞哥分校生物工程系教授，美國醫學與生物工程院會士，Genemo 公司的共同創始人。他曾師從王永雄教研究生物信息學。他的實驗室主要研究基因調控如何影響細胞行為。實驗室通過開發新的生物技術來繪制分子網絡，包括RNA-RNA 相互作用組，RNA-DNA相互作用組和蛋白質相互作用組, 進而開發基于核酸的體外檢測方法和治療技術。他和錢煦教授共同擔任美國國立衛生研究院共同基金四維核體組織中心主任。Genemo公司提供基于SILVER-seq技術的液體活檢服務 (https://genemo.com) 。

　　參考資料：

　　Extracellular RNA in a single droplet of human serum reflects physiologic and disease states.