液體活檢助力消化道腫瘤診療

液體活檢是近幾年來興起的一種分子檢測手段，可以幫助臨床醫生早期篩查和發現腫瘤，為腫瘤的早期診斷提供了一種比常規腫瘤標志物靈敏性及特異性更高的替代方法。同時，液體活檢還具有實時監測治療療效和耐藥基因的產生，評估復發轉移風險的作用，在腫瘤的精準治療中具有重要臨床應用前景。本文主要對液體活檢的生物學特性及其在消化道腫瘤中的臨床應用進行概述。

2018年全球癌癥統計數據顯示，全球新發腫瘤的發病率排名中，結直腸癌排名第三位，占10.2%；胃癌排名第五位，占5.7%；全球腫瘤死亡率中，結直腸癌排名第二位，占9.2%；胃癌、肝癌并列第三位，分別占8.2%[1]。在我國，胃癌、肝癌、食道癌等消化道腫瘤占所有腫瘤發病率的50%，死亡率占36.4%。目前消化道腫瘤的診斷依靠醫學影像學技術、血清腫瘤標志物和組織活檢等方式。影像學檢查常常滯后于疾病發生，并且無法判斷微小病灶。血清腫瘤標志物(如CEA、CA-199等)的敏感性、特異性有限。組織學活檢雖是診斷“金標準”，但對人體創傷大，患者依從性差，無法動態監測。因此，尋找特異度及靈敏度高、患者耐受性好的檢查方法至關重要。

液體活檢是對體液(血液、唾液、腦脊液或尿液)中的物質進行分析，循環腫瘤細胞、循環腫瘤DNA和外泌體等[2]是目前的主要檢測項目。液體活檢技術具有非侵襲性、可動態觀察、操作簡單等特點，在腫瘤的臨床分期、療效及預后判斷、個體化化診療中發揮了巨大作用。

1 液體活檢的生物學基礎

1.1 循環腫瘤細胞

循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)是指從實體腫瘤上自然脫落后進入到血液中的癌細胞，可以單個存在也可以聚集成團。循環腫瘤細胞最早由Ashworth教授于1869年在一位癌癥患者血液中通過與其他腫瘤細胞形態學進行比較而發現的[3]。雖然CTCs的發現有150多年歷史，但由于當時技術原因，直到近二十多年，CTCs才得到廣泛關注。血液中的CTCs數量極少, 每109個血液細胞中只有1~10個CTCs[4]。因此在檢測CTCs前需要進行富集，目前的富集方法主要有免疫磁珠分離技術、密度梯度離心技術和基于腫瘤細胞大小的分離法[5-6]。但對于同一癌腫，各富集方式的結果也各不相同。因此，在臨床實施前需要進一步細化和標準化。

1.2 循環腫瘤DNA

循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)通常是指腫瘤細胞凋亡后進入外周血循環的游離核酸，一般由70~200個堿基對組成[7]。1994年，首次在游離DNA中發現突變的KRAS基因，并證明了外周血中的突變DNA片段來源于腫瘤[8]。并且，有研究證明外周血中ctDNA數量與腫瘤負荷成正比[9]。ctDNA的半衰期時間很短，一般在15 min至2.5 h，然后被肝臟或腎臟代謝清除，因此，快速的清除時間使得臨床醫生只能對短短幾小時而不是幾周的腫瘤進行評估[10-11]。目前ctDNA的檢測方式主要有兩大類，一類是基于聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction PCR)技術，其敏感性較高，但只能檢測已知的突變位點。另一類是基于二代測序(next generation sequencing，NGS)技術，可檢測未知突變，但檢測過程復雜，成本高，耗時長[12]。

1.3 外泌體

外泌體(exosome)是一種納米大小的微囊泡(直徑30~100 nm)，是由晚期多囊泡膜向內出芽將細胞內物質包裹，與質膜融合后，外泌體被分泌到細胞外，遷移到遠處，甚至跨越生理屏障，如血腦屏障。1986年，Johnstone在綿羊紅細胞中發現了外泌體的存在。隨著研究的不斷深入，科學家們發現其內富含蛋白質、核酸、脂質等生物活性物質，是參與細胞間物質交換、信號傳導的重要媒介。外泌體的生物學效應主要包括呈遞抗原、免疫調控、損傷組織修復等。研究表明，從腫瘤細胞中脫落的外泌體(TEXs)可作用于上皮細胞，促使腫瘤轉移[13]，另外，它還能下調NK細胞的活性，誘導免疫逃逸[14]。

2 液體活檢在消化道腫瘤診療中的應用

2.1 液體活檢在消化道腫瘤早期篩查及診斷中的作用

利用液體活檢對消化道腫瘤進行篩查診斷和疾病復發評估已成為目前的熱門研究。ctDNA作為液體活檢中的一部分，在早期診斷中有著重要作用。ctDNA在血液中的含量較少，導致ctDNA檢測的陽性率低。Molparia等[15]在一項研究中通過細胞游離DNA測序(cell free DNA sequencing)檢測大規模體細胞拷貝數變異(CNV)，與點突變檢測相比，CNV檢測檢出率更高。將25名早期結直腸癌患者作為實驗組和24名健康者作為對照組進行CNV檢測，區分實驗組和對照組的特異性達到100%、敏感性達到79%。Bettegowda等[16]使用dPCR技術對640例不同癌腫患者進行ctDNA檢測，分別有73%、57%、48%的非轉移性結直腸癌、胃食管癌、胰腺癌患者血液中檢測到ctDNA。Cohen等[17]也通過同樣的方法對221例早期胰腺癌患者進行ctDNA檢測，66例患者的血中檢測出KRAS基因突變，敏感性為30%，考慮ctDNA檢測在胰腺癌中敏感性較低，Cohen學者進一步探究KRAS基因結合CA199是否能提高單獨KRAS基因檢測的敏感性，結果發現KRAS基因結合CA199組的敏感性提高到了64%，在對照組中只有1例檢測到了KRAS基因突變或CA199陽性，特異性為99.5%。因此，ctDNA檢測在大多數消化道腫瘤中的特異性和敏感性較高，可作為消化道腫瘤早期篩查和診斷的一種手段。ctDNA檢測聯合蛋白生物標志物檢測可以提高檢測靈敏度。

近年來外泌體作為一種新型腫瘤標志物得到了研究者的廣泛關注。最新的一項研究采用免疫印跡試驗方法對92例結直腸癌患者和32例健康對照者的外泌體來源的CPNE3蛋白含量進行檢測，發現結直腸癌患者CPNE3蛋白表達明顯高于正常對照組，并且Ⅲ~Ⅳ期患者CPNE3蛋白的表達高于Ⅰ~Ⅱ期患者。研究者進一步繪制ROC曲線將CPNE3與常規腫瘤標志物CEA進行比較，發現CPNE3的AUC值為0.791，其對結直腸癌檢測的敏感性和特異性為67.4%、84.4%。而CEA的AUC值為0.728，其對結直腸癌檢測的敏感性和特異性為54.3%、93.7%。當CPNE3聯合CEA時，對結直腸癌檢測的敏感性和特異性為81.2%、84.8%[18]。由此可見，CPNE3的靈敏度較高可用于結直腸癌的早期診斷及分期；將外泌體與蛋白生物標志物檢測可以提高靈敏度及特異性，從而提高診斷的準確性。綜上，利用液體活檢技術可早期篩查和診斷消化道腫瘤，值得臨床推廣。

2.2 液體活檢在消化道腫瘤治療效果評價中的作用

液體活檢不僅可以早期篩查和診斷消化道腫瘤，同時也可以評價治療效果，指導臨床用藥。Chen等[19]收集了65例食管癌患者，對39例局部晚期不能直接手術的食管癌患者進行了2周期術前新輔助化療，化療前及每周期化療后2~3周內分別檢測CTCs，以RECIST1.1版進行評效。達到完全緩解(complete response, CR)或部分緩解(progressive disease, PR)的患者中多次(2~3次)檢測CTC陽性的頻率為31.8%，疾病穩定(stable disease, SD)或疾病進展(progressive disease, PD)的患者多次(2~3次)檢測CTC陽性的頻率為70.6%(P=0.03)。對26名早期食管癌單純手術患者進行術前及術后CTCs檢測，發現術后CTCs明顯下降(P=0.037)。國內研究也同樣證明了局部晚期食管癌新輔助放化療后CTC仍然陽性的患者較CTC轉陰的患者中位生存時間短[20]。一項前瞻性的研究納入了82名轉移性結直腸癌患者，在一線或二線化療的第一、三周期化療前采血檢測ctDNA，發現化療后ctDNA濃度下降組較上升組無進展生存時間(progression-free survival, PFS)和總生存時間(overall survival, OS)長[21]。多項研究表明在轉移性結直腸癌中，ctDNA濃度隨著化療有效和獲得耐藥而升高、降低[22-23]。ctDNA在胰腺癌中的研究也有類似的發現，ctDNA的變化與CA19-9水平、疾病進展密切相關[24-25]。這表明ctDNA的動態監測可能成為血液腫瘤標志物測定的一種替代方法。ctDNA不僅能檢測藥物反應還可以檢測耐藥基因。在藥物治療過程中，由于腫瘤微環境改變、腫瘤異質性等多種原因可引起腫瘤細胞耐藥。ctDNA檢測RAS、BRAF和EGFR耐藥相關突變具有很高的敏感性[26-27]。Helden等[27]對接受三線西妥西單抗治療的晚期結直腸癌患者的ctDNA進行分析，發現治療2周期時有病灶縮小的患者血液中的ctDNA數量明顯減少，而出現疾病進展時BRAF或NRAS突變總數較基線時明顯增加。Knebel等[28]發現在治療KRAS野生型晚期結直腸癌期間使用ctDNA監測到KRAS抗性突變可以比影像學發現疾病進展早2個月。王蕾[29]的研究也同樣證實了實時液體活檢可以監控耐藥基因的變化，且明顯早于影像學評估疾病進展。由此可見，除了目前常用的腫瘤標志物外，液體活檢技術也可以作為治療療效的監測手段之一，同時可以檢測耐藥基因的出現，及時調整后續治療手段，進一步做到精準治療。

2.3 液體活檢在消化道腫瘤預后評價中的作用

液體活檢與腫瘤負荷有著密切的聯系，通過液體活檢可以篩選有高復發風險的患者，也可以了解疾病進展和預后情況，目前的研究已表明液體活檢作為評估胃腸道腫瘤預后工具有巨大價值[25, 30-31]。

一項包含了2363名非轉移性結直腸癌患者的薈萃分析結果顯示，CTCs與無病生存時間(disease-free survival, DFS)和總生存時間顯著相關[32]。Herbst等[33]對467例轉移性結直腸癌患者進行研究，檢測甲基化HPP1對預后的影響，發現轉移性結直腸癌患者血清中甲基化HPP1存在與疾病進展和總生存時間縮短有關。這一結果與Tham等[34]的一致，通過對Ⅰ~Ⅲ期結直腸癌患者的甲基化TAC1和SEPT9進行檢測，證實了甲基化TAC1和SEPT9是腫瘤復發的獨立預測因素，且較CEA特異性及靈敏性高。最近一項研究表明，與CEA相比，ctDNA中的兩個及以上基因能夠檢測到兩倍的復發患者[35]，同樣證實了ctDNA對疾病復發的監測比CEA更敏感。Yao等[36]指出，ctDNA中的基因突變狀態可以作為轉移性結直腸癌預后指標。液體活檢在胃癌中也同樣具有評價預后的作用[37-39]。Liu等[38]對晚期胃癌化療患者進行研究，發現化療后CTCs計數升高患者組比CTCs降低患者組的PFS及OS短，且基線CTCs計數>2是PFS和OS的獨立不良預后指標。此外，CTCs數目還與局部淋巴結轉移、神經纖維浸潤、腫瘤浸潤深度有關[39]。CTCs中的存活蛋白(Survivin)表達已被證明可以作為胃癌預后的獨立因素[40-41]。Cao等[40]在對98例接受過胃癌根治性切除術的患者的研究中發現，術后存活蛋白表達程度與腫瘤浸潤深度、大小及淋巴結轉移數量有關。2013年的一項薈萃分析(包括16項研究和1365名患者)也指出存活蛋白表達與胃癌患者預后不良有關[41]。但有趣的是，只有細胞質中的存活蛋白表達對總生存率有顯著影響，而細胞核中的表達對預后無影響。因此，通過監測基因的改變能夠很好的提示疾病發展情況，并且可以比影像學更早預測腫瘤復發，降低疾病復發率。

3 小結

液體活檢是一項基于體液的檢測技術，在癌癥診療中有著廣泛的應用價值。液體活檢的主要優勢包括對腫瘤突變部位進行基因分型、監測治療反應、揭示耐藥性和實時選擇治療方案的實用性。液體活檢的高特異性，以及血液的同質性，使其成為現代腫瘤研究中不可或缺的工具。目前液體活檢仍面臨巨大困難，首先，應該尋找靈敏性和特異性更高的檢測方式；其次，應規范檢測流程，包括樣本取材方式，運輸及保存方式以及檢測方式。最后，還需要更多大樣本、多中心、大規模前瞻性臨床研究證實液體活檢對臨床診療的作用。相信在不久的將來，液體活檢能夠廣泛應用于臨床，為患者提供更加及時、精準的個體化治療方案。

參考文獻

顧心怡, 李賀明, 王喆, 等. 液體活檢在消化道腫瘤診療中應用的研究現狀. 大連醫科大學學報, 2020, 42(1): 76-80. DOI: 10.11724/jdmu.2020.01.16.