化學發光假陽性本底產生的原因分析

近期收到有小伙伴提問，關于如何解決發光試劑盒研發過程中的本底偏高和假陽性問題。解決問題最重要的是了解問題產生的原因，本微信平臺分類匯總了化學發光試劑產生假陽性本底的原因，由于問題本身并沒有很具體的描述，因此本文也只廣泛的匯總，不包含具體的項目或者方法學方面的內容。希望對大家的工作有所幫助。

抗原/抗體原料因素

• 融合表達蛋白對抗原特異性的影響。融合蛋白包含載體的一些序列，比如可以與血清中抗大腸桿菌的因子發生反應而產生假陽性。

• 合成蛋白原料錯誤排序或突變。合成蛋白在制備過程中，以下情況可能會導至原料特異性改變而產生假陽性：a.核苷酸發生相位改變；b.某些蛋白肽序列錯誤；c.核苷酸出現點突變。

• 人抗鼠抗體效應（HAMA效應）。鼠源性單抗對人體具有異種蛋白的免疫原性，因此部分假陽性反應由于人對鼠抗體反應HAMA（人抗鼠抗體效應）引起，當試劑中的阻斷劑效果不理想時，檢測樣本就會出現高陰或假陽性。

• 抗原/抗體純度對特異性的影響。目前原料制備的純化工藝有限，原料中的其它雜蛋白可引起假陽性。
  

人血清中的IgG  

• 正常人血清中的IgG：IgG濃度對抗體檢測有較大的影響，尤其是間接法檢測抗體項目。成人血樣中的IgG濃度為7～16.5mg/ml，個別樣本的IgG濃度會更高，這些樣本檢測時易顯示假陽性。 

• 人血清中異常的 IgG：孕婦懷孕期間會產生特殊抗體；自身免疫性疾病易引起抗體檢測假陽性，如：當患有類風濕關節炎、結締組織病等病癥時，血清中的異常IgG升高會引起本底升高或假陽性。

樣本處理不當引起

• 樣本中的纖維蛋白原：如果血液樣本凝固不完全，血清中仍留部分纖維蛋白原，在化學發光測定過程中，磁微粒和纖維蛋白原形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成高陰或假陽性結果。

• 樣本溶血：樣本中紅細胞破裂，血紅蛋白逸出稱紅細胞溶解，簡稱溶血。當檢測樣本溶血時，血紅細胞中的亞鐵血紅素具有過氧化物酶的作用，其通過吸附或者 “PP” 效應，易引起假陽性免疫反應。 

• 樣本染菌：細菌污染樣本時，菌體中或細菌分泌物中可能含有某些物質，會產生假陽性反應；

• 樣本保存時間過長：在冰箱中保存時間過長導至血清IgG聚合，易使間接法等的試驗本底加深；

操作不當

任何不符合規范的操作都會影響檢測結果，因此在實驗操作過程中應該嚴格保證操作的規范性。

嚴格按照儀器和試劑說明書進行實驗操作是得到準確結果的關鍵。

全自動化學發光平臺，已經大大降低了手工操作引起的各種操作問題和實驗結果誤差，但是仍然有一些需要注意的事項，避免引起本底的升高或者假陽性。

• 使用樣本量不足的樣本：當樣本量不足，加樣模塊識別不夠精密時，樣本中的血紅蛋白或凝膠就會被當成樣本吸入加樣，導至磁微粒凝集成塊，造成高陰或假陽性結果。

• 洗滌不充分：稀釋洗液的水應該是新鮮的純化水，電導率小于1.2μs。如果水中含有過多的金屬離子，這些離子會占用表面活性劑，影響洗滌效果。如果洗液被微生物污染，不僅洗滌效果會受很大影響，還會帶來其他干擾物質。

• 加樣針、反應杯等耗材：加樣針、反應杯應保證干凈無污染。

• 實驗室環境：應注意避免84消毒液等強氧化劑消毒液影響實驗反應。