經過 Protein Deconvolution 2.0 軟件去卷積處理之后的單抗分子質量分布圖（圖 3），根據單抗的氨基酸序列理論分子質量進行計算，將觀察到的質譜峰進行歸屬，可以初步推斷該單抗藥物存在多種形式的糖鏈結構，主要包括 G0、G0F、G1F 和 G2F，該結論與常見的單抗組成基本一致，同時根據質譜峰的峰強度信息，我們還可以計算得到不同糖型單抗的相對定量信息，如圖 3 中藍色數字所示。
圖 3. LTQ-Orbitrap Elite 質譜采集的單抗原始質譜圖經過 Protein Deconvolution 2.0 軟件去卷積處理之后的單抗分子質量分布圖（G0、G0F、G1F 和 G2F 表示不同類型的糖型，藍色數字表示質譜峰所對應的峰強度和相對定量信息。）
3.2 氨基酸序列測定
經過 LTQ-Orbitrap Elite 質譜數據采集和 Proteome Discoverer 1.3 軟件的數據庫搜索，以及肽段 99% 高置信水平卡值，在 trypsin酶解實驗中，單抗重鏈的蛋白序列覆蓋度為 97 %，如圖 4-A 所示，輕鏈的蛋白序列覆蓋度為 98 %，如圖 4-B 所示，由此證明LTQ-Orbitrap Elite 質譜可以準確、有效地實現單抗氨基酸序列的成功鑒定。其中未鑒定到的氨基酸序列主要是由于酶切后肽段過短不適合質譜鑒定所造成的，為了實現 100% 的氨基酸序列覆蓋，可以通過選擇其它內切蛋白酶來實現。
單抗蛋白中一般都包含 N-糖基化修飾，也就是說肽鏈的天冬酰胺（Asn，N） 殘基可以與糖鏈的還原端連接，形成不同糖鏈結構的糖基化蛋白，一般發生 N-糖基化修飾的位點都是在保守序列 NXS 或 NXT 中（X 為除脯氨酸外的任意氨基酸）。在經過內切糖苷酶 PNGase F酶切后，天冬酰胺（Asn，N）殘基會丟失糖鏈，產生 0.984 Da 的質量增加。不過在樣品處理過程中也可能會導致天冬酰胺、谷氨酰胺發生脫氨基化，同樣會使天冬酰胺產生 0.984 Da 的質量增加。最終的搜庫結果顯示一些天冬酰胺殘基存在0.984 Da 的質量增加，這可能是由于樣品發生了脫氨基化或者 N 糖鏈被酶解所致，進一步結合 N 糖基化位點的特定 NX(X≠P)S/T結構域信息，我們初步推斷該單抗中唯一可能發生糖基化的位點為：重鏈中氨基酸序列 EEQYNSTYR 中的 N 位點，為了得到準確的定性結果，我們進行了后續的糖基化位點鑒定實驗。
圖 4. 單抗經過 trypsin 酶解和 LTQ-Orbitrap Elite 質譜實現的氨基酸序列覆蓋度示意圖（A為重鏈氨基酸序列覆蓋示意圖，B 為輕鏈氨基酸序列覆蓋示意圖，其中綠色標記的氨基酸序列表示該段序列鑒定的可靠性非常高，達到 99% 以上，紅色標記的氨基酸序列表示該段序列鑒定的可靠性為 95% 以下，無顏色標記的氨基酸序列表示該段序列沒有被鑒定到，氨基酸序列上方的數字代表氨基酸的位置。）
3.3 糖基化位點確定
經過 LTQ-Orbitrap Elite 質譜數據采集和 Byonic 1.1 軟件的數據庫搜索，共鑒定到 6 個糖基化修飾的肽段，分別對應于 G0（
）、G0F（
）和G1F（
）（紅三角表示巖藻糖，藍方塊表示 N-乙酰氨基葡萄糖，綠圓表示甘露糖，黃圓表示半乳糖）等，每一條糖肽都經過人工確認，以其中的
EEQYN（G0F）STYR 糖肽為例，如圖 5 所示，在二級質譜中，可以觀察到 6 個糖診斷離子（見表 5）和 8 個糖肽碎片離子（見表
6），同時結合 N 糖基化修飾位點的特定結構域信息，從而確證該肽段中天冬酰胺（N）殘基為 N-糖基化修飾位點。
由于采用了高分辨、高精度的 LTQ-Orbitrap Elite 質譜，糖診斷離子的質量偏差都在 1 ppm 以內，除了個別碎片離子外，基本所有的糖肽碎片離子的質量偏差也都在 1 ppm 以內，由此可以判斷該糖肽碎片離子的歸屬準確、可靠。
表 5. EEQYN（G0F）STYR 糖肽經過 LTQ-Orbitrap Elite 質譜鑒定到的糖診斷離子列表
表 6. EEQYN（G0F）STYR 糖肽經過 LTQ-Orbitrap Elite 質譜鑒定到的糖肽碎片離子列表（紅三角表示巖藻糖；藍方塊表示N-乙酰氨基葡萄糖；綠圓表示甘露糖）
圖 5. LTQ-Orbitrap Elite 質譜采集的 EEQYN（G0F）STYR 糖肽的二級質譜圖（紅三角表示巖藻糖；藍方塊表示 N-乙酰氨基葡萄糖；綠圓表示甘露糖）
4. 結論
本文通過 LTQ-Orbitrap Elite 質譜建立了單抗藥物的整體分子質量測定、氨基酸序列鑒定和糖基化位點確認的分析方法，為常規單抗藥物研發分析和實時生產檢測提供了高效、快速的分析平臺。實驗結果表明 LTQ-Orbitrap Elite 組合式質譜儀，憑借其超高的分辨率，超快的掃描速度，超高的質量精度、超低的靈敏度和超大的動態范圍，極大地完善和推動了單抗藥物的鑒定分析。