單細胞的可靠全基因組擴增

目前多種新型分析技術，如新一代測序和芯片，都是為細胞群體而設計的，需要一定的樣本量。對于一些臨床或法醫樣本，如腫瘤細胞或循環胎兒細胞等，它們的細胞數量有限，直接限制了其下游應用。例如，在分析腫瘤細胞中的體細胞DNA突變或單個細菌基因組時，單細胞中的DNA無法滿足測序的mg級樣品量需求。為了從少量樣品中獲得更多信息，全基因組擴增技術（WGA）應運而生。

全基因組擴增的目的是在沒有序列偏向性的前提下大幅增加DNA的總量。之前常用的技術有DOP-PCR和PEP-PCR等。然而，這些基于PCR的方法會產生非特異的擴增假象，影響實驗結果。為此，QIAGEN推出了全基因組擴增產品REPLI-g Single Cell Kit，讓研究人員在使用測序和芯片平臺時能獲得值得信賴的結果。

REPLI-g Single Cell Kit能夠從單細胞（如分離的腫瘤細胞或細菌）中獲得高產量的擴增DNA。它可用在廣泛的應用中，使用各種臨床和非臨床研究樣品，包括已純化的基因組DNA（gDNA）、新鮮或干燥的血液，以及新鮮或冷凍的組織（表1）。REPLI-g Single Cell擴增后的DNA產物平均長度> 10 kb，且完整覆蓋基因組，高度適合也已經開發用于新一代測序（NGS）、芯片法比較基因組雜交（array CGH）或qPCR分析（表2）。

新加坡基因組研究院的副研究員Masafumi Muratani博士已經試過了這個試劑盒，并成功開展了單細胞全基因組擴增。他表示：“獲得的DNA讓我能可靠檢測一個結腸直腸癌細胞系中等位基因特異的點突變。擴增后DNA的出色產量和序列代表性確實幫助我推進了單細胞基因組學的研究工作。”

表1. 樣品材料和研究領域的范圍

樣品材料（細胞/DNA）

研究領域

人/動物

生物標志物研究（SNP、突變、CNV）

干細胞研究

循環胎兒細胞的分析

嵌合研究

遺傳易感性研究

轉基因動物的分型

癌癥

體細胞遺傳變異分析

腫瘤發展

腫瘤干細胞/進化

循環腫瘤細胞的分析

細菌

宏基因組學研究

病原體分析

微生物基因分型

植物*

氣孔研究

花粉分析

* 無細胞壁的細胞或已純化的基因組DNA。

表2. 下游應用及儀器

應用

研究領域

全基因組測序

外顯子組測序

新一代測序平臺

SNP基因分型芯片

Array CGH

芯片平臺

qPCR/PCR技術

實時定量PCR/PCR循環儀

Sanger測序

毛細管測序儀

焦磷酸測序

PyroMark?（QIAGEN）

原理

REPLI-g Single Cell Kit包含了REPLI-g sc聚合酶。它是高保真Phi 29聚合酶的優化配方，具有強的置換活性，可通過多重置換擴增（MDA）擴增復雜的基因組DNA，而溫和的堿變性步驟可防止DNA片段化并產生脫堿基位點。Phi 29聚合酶確保了基因座的均勻擴增，它最多能復制70 kb而不與基因組DNA模板解離，實現了基因座的均勻擴增。與基于PCR的WGA技術不同，Phi 29聚合酶有著3’→5’的核酸外切酶校正活性，在復制時其保真度比Taq DNA聚合酶高出1000倍。

多重置換擴增（MDA）技術的過程如下：引物（箭頭所示）與模板DNA退火，并利用在DNA模板鏈上移動的Phi 29聚合酶在30°C延伸，取代互補鏈，同時自身成為復制的模板。與PCR擴增不同，MDA不需要不同的溫度，且最終的片段非常長，突變率低。

REPLI-g Single Cell Kit使用專門的緩沖液和試劑，反應設置簡單，且處理時間僅為15分鐘，能夠為單細胞、有限的組織材料和已純化的DNA帶來高純的全基因組擴增DNA，且序列代表性和無偏向擴增最大化。這些獨特的組分，以及創新且標準化的UV處理步驟，能夠消除任何可檢測到的殘留污染DNA，確保僅來自單細胞的高質量結果。

REPLI-g Single Cell Kit提供了：

? 單細胞材料的全基因組擴增，且基因組覆蓋最大化
? MDA技術帶來的基因座的無偏向擴增
? 經優化可用于新一代測序等新技術
? 高達40 μg的一致產量（產物平均長度 > 10 kb）
? 一種創新的工具（適合癌癥研究和宏基因組學）

 

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