單細胞蛋白質組學：讓細胞個體研究更加精細

    細胞是生命活動的基本單元。對細胞的精確認知是理解細胞在生理和病理過程中功能的先決條件。

    在組織、器官或個體中，細胞具有非常大的異質性，而傳統的研究手段針對大量細胞進行分析，得到的是大量細胞的平均結果，無法區分不同細胞個體對于大量樣品結果的具體貢獻值，從而忽視或掩蓋了單細胞的個體差異，不能完全捕捉細胞的復雜性、多樣性以及功能的不同。

    因此非常有必要開發新技術在單細胞水平揭示細胞異質性，目前對單細胞技術的需求越來越高。

PART01 實現單個細胞蛋白質組成的定性定量分析，揭示細胞個體之間的精細差異

    二代測序技術的持續發展使對單細胞基因組和轉錄組的研究突飛猛進，科學家們對細胞認識的分辨率大大提高，然而單細胞的基因組和轉錄組數據對描述細胞在生物體復雜環境中的表型和功能還遠遠不夠，而蛋白質作為細胞內所有功能的直接執行者，細胞通過蛋白質及其翻譯后修飾，可以感知并響應幾乎所有外在和內在的刺激，從而影響整個生命體的功能和狀態。

    因此，對單細胞蛋白質組的定性和定量分析，是揭示細胞類型及其狀態的必不可少工具，在腫瘤異質性、干細胞分化、生殖細胞發育、循環腫瘤細胞等重要領域有著不可或缺的應用價值。

    單細胞蛋白質組學的目的就是為了實現對單個細胞內蛋白質組成的定性和定量分析，從而獲得不同細胞個體蛋白組的定性和定量差異，構建精細蛋白分子圖譜，從根本上揭示不同細胞個體之間的類型及其狀態的差異，使科研工作者可以更好地了解細胞及其表型和生命活動。

PART02 挑戰單細胞蛋白質組學研究的難點和瓶頸

    單細胞蛋白質組學技術的難點和瓶頸主要在于單細胞內極其微量的蛋白質，一般單個細胞內的蛋白質總量僅不到200 pg，而其又是由上萬種不同種類的蛋白質組成，這些蛋白質以極高的動態范圍、不同的拷貝數存在于一個單獨的細胞中。

    直接對這些蛋白質進行組學鑒定分析，在其樣品前處理、分離和質譜檢測都是一種挑戰。因此受到極微量樣本制備、超高靈敏度高分辨生物質譜儀等限制，單細胞蛋白質組學分析一直都是“圣杯”一樣存在。

PART03 百花齊放，各有所長

    目前為解決單細胞極微量樣本制備的難點，科學家們開發出來一種體系是基于TMT進行標記的方法，如scope2。

    Scope2研究系統主要是通過TMT的多通道優勢，將其中一個通道作為carrier cell通道，一般為20~200個細胞量的樣品，其他通道作為單細胞通道。各通道在完成TMT標記后進行混合上機檢測。

    采用carrier cell通道的優點有如下幾點，第一、可以有效補償單細胞樣品在后續分析中的損失；第二、其對蛋白質的定性可以使用含量更高的carrier cell通道中的MS/MS，而借助TMT各通道報告離子進行定量；第三、大大提高單細胞檢測的通量。

基于scope2技術的單細胞蛋白質組學分析流程 https://doi: 10.1186/s13059-021-02267-5 

    除此之外，還有研究者采用基于液滴的樣品前處理系統，如nanoPOTS、gOAD、nested nanoPOTS(N₂) chip和proteoCHIP系統，這類系統主要優點有：1）液滴體積小可以減少與管壁接觸轉移帶來的樣品損失問題；2）小體積液滴與單細胞樣品兼容性更好，具有更高的酶切反應速率。但也有其不足之處，比如該液滴操作系統需要在具備相關操作能力的實驗室開展，還需開發適用于液滴體系上樣的新技術。

基于液滴體系的樣品前處理和離心處理上樣系統proteoCHIP的工作流程https://doi.org/10.1101/2021.04.14.439828

    其中在N₂ chip和proteoCHIP系統中結合了微流控液滴和TMT標記的技術，可進一步提高單細胞分析的檢測通量和定量蛋白質數目。

    此外，還有一類是結合超高靈敏度質譜儀timsTOF和DIA采集模式，在前處理過程中縮小反應體系到2ul左右以此減少樣品損失，實現單細胞的蛋白質組學分析。

基于液滴體系的樣品前處理和液滴自動進樣器的N2系統工作流程https://doi.org/10.1101/2021.02.17.431689

基于Evosep和timsTOF-DIA聯用的單細胞樣品前處理系統https://doi.org/10.1101/2020.12.22.423933

PART04 精準醫學應用領域突破創新性進展

    通過單細胞蛋白質組學分析可以根據差異蛋白質信息來區分不同腫瘤細胞的分子分型，相較于傳統的病理組織分析技術更加精細準確，對于理解疾病的發生發展具有重要的意義。

    另外，一些生物學樣品由于稀少，單細胞技術是唯一可以對其進行研究的技術。例如在胚胎發育早期階段少量個數的細胞、在神經生物學領域越來越得到重視的單個神經元以及數量稀少的循環腫瘤細胞等，傳統蛋白組學技術無法獲得這類樣品的蛋白質組學數據，因此單細胞蛋白質組將是必要的手段，對于組織亞結構研究、胚胎發育、腫瘤異質性、CTC細胞、干細胞分化和神經研究提供重要的生物學意義。

基于質譜的單細胞蛋白質組研究進展

    蛋白質是生命活動生理功能的執行者，它更直觀的表現生命的活動現象，它直接參與機體的免疫應答、免疫調節和催化過程。

    蛋白的表達的差異的水平會更直觀的反應機體的生理狀況和發病機制，蛋白質的定量檢測對疾病的診斷、預后評價有著重要的意義。

    我們通常研究的蛋白質組更多的是通過基因組、轉錄組的信息對蛋白信息進行預測，從中心法則DNA到mRNA再到蛋白，由于轉錄水平調控、翻譯后水平調控、翻譯后調控的存在使得DNA的遺傳信息和mRNA水平豐度不能真實的直接反映蛋白質的功能和表達水平。

    傳統組織上的蛋白定量更多的是反應細胞中蛋白表達的平均值，由于遺傳因素、生化噪音、細胞微環境等諸多因素使得細胞和細胞之間存在廣泛的異質性。

    如果能從單個細胞反映生命活動的直接體現者，不僅對生命的本質有更深的認識，而且會為疾病的診療提供強有力的支持。

    相對與對基因表達分析，測定單個細胞中的蛋白是個更大的挑戰,單細胞的蛋白含量非常低，平均每個細胞中約包含8*10⁹個蛋白質分子（700pg），但卻含有一萬多種蛋白質，某些種類的蛋白質分子甚至小于100個。蛋白的表達量的測定無法直接像DNA、RNA那樣直接擴增。

    在2020年發表在頂級期刊的MCP（Mol Cell Proteomics）的綜述（single-cell proteomics: progress and prospects）：單細胞蛋白質組學進展與展望中文章從也對樣品制備、到質譜儀、方法學的難點進行詳細討論。

    當然基于不同的原理、針對不同的應用場景近些年來也涌現了很多單細胞蛋白質定量的的檢測方法，比如微流控技術、微孔技術、光纖納米生物傳感技術、熒光探針技術和基于質譜的單細胞蛋白檢測技術。

    如微流體技術Health課題組通過單細胞條碼芯片( single-cell barcode chip，SCBC) 的方法來進行單細胞蛋白檢測，對單個腫瘤的細胞蛋白質進行了多重分析。

    Huang等也利用微流控技術在一張芯片上完成細胞的處理、裂解、標記、分離和蛋白定量檢測過程，Salehi-Reyhani等基于微流控抗體芯片實現單細胞中P53腫瘤抑制蛋白豐度檢測,該方法更多的用于蛋白和蛋白間的會做及磷酸化的作用的研究。

以Health 課題組微流控舉例（如上圖）

a)單細胞、細胞內蛋白質分析裝置的示意圖。

將單個或少數細胞置于不同刺激下的隔離室中培養。通過引入預先引用的裂解緩沖液來檢測細胞內的蛋白質，釋放的蛋白質在腔內結合到DNA條形碼上。

V1:裂解緩沖液控制閥，V2:隔離室形成閥，R1: DNA條形碼陣列轉換成DEAL抗體陣列

b) c)已開發的條形碼檢測的對比增強圖像。用紅色字體列出的蛋白質名稱與使用條形碼檢測的蛋白質名相稱對應

d) b單細胞裂解液具有代表性的熒光強度分布圖

    微流控技術本身更依賴于裝置的設置，裝置的設置決定于單細胞蛋白檢測的通量,一般情況下檢測10-1000個不等的蛋白，具有很高效益和靈敏度，但是自制的微流控很難保證一個微室保證一個單細胞。

    微孔技術對于單細胞蛋白的檢測方法包括數字化酶聯免疫吸附測定法、單細胞蛋白印跡法、基于DNA的納米免疫測定法，它們主要的缺點和微流控一樣，不同的微孔中存在差異，難以保證一個微孔正好捕獲一個細胞。

    而質譜的方法其靈敏度較高，通過已有的蛋白質組學數據庫，同時可以對上萬種蛋白同時進行定量。我們重點和大家分享基于質譜的單細胞蛋白質組的研究方法。

    質譜的單細胞蛋白質組主要需要解決樣本的復雜性和提高單細胞的靈敏度，質譜前處理和分離技術的選擇對此發揮著至關重要的作用，根據質譜分析前分離技術的差異，主要從毛細管電泳-質譜（CE-MS）、液相色譜-質譜（LC-MS）進行簡要介紹。

1.單細胞蛋白質組之毛細管電泳-質譜（CE-MS）

    早在2014年，Sun等通過電驅動鞘液型接口將毛細管區帶電泳與串聯質譜結合，實現300ngHela細胞的蛋白酶解液中鑒定2100種蛋白，最低的檢測限可以低至 2 amol。

    除了在Hela細胞進行測試，Nemes課題組首次較大的單細胞進行內源的蛋白質分析-16－細胞非洲爪蟾早期胚胎的囊胚細胞。

    首先通過顯微解剖的方法從胚胎中分離單細胞，然后裂解、還原、烷基化，最后通過毛細管電泳-升電噴霧-高分辨質譜（CE-μESI-HRMS）從直徑約150μm的20ng單個囊胚細胞鑒定1630種蛋白。

    除了通過顯微解剖的方法還可以通過微采樣的方法，微采樣的方法消耗樣本量少，流程簡化，排除顯微方法使用基質使得單細胞的蛋白鑒定更準確。

    比如Lom-bard-Banek等對胚胎進行亞細胞區域采樣，提取物在壓力的作用下轉移至微量移液管中進行胰蛋白酶解，最后實現進樣10nL酶解液，利用利用毛細管電泳-納升電噴霧-高分辨質譜分析，最低低于700z mol的檢出下限，在5ng蛋白酶解液中鑒定不少于800個蛋白。盡管蛋白的量和檢測下限逐漸減少，但樣本的復雜度依舊很高。

    Choi等通過CE前加入用于預分離的反相C18柱，對單細胞水平的老鼠海馬體神經元蛋白酶解物進行分析，最后從500pg的蛋白酶解物鑒定141個蛋白。

    這一靈敏度近乎達到了單細胞的水平，但是樣本的復雜度還不是單個細胞的水平；為了近乎接近單個細胞的水平，利用毛細管的微小管徑實現單細胞內容物的轉移。

    如Zhang等通過利用管徑10μm的毛細管對田螺特定的神經元細胞質和細胞核取樣，利用離子淌度質譜（IMMS）發現了新的神經肽，揭示了神經元細胞內區域表達的異質性。

    通常CE-MS的研究應用更多集中在大體積的細胞上，實驗流程基本和常規蛋白質的提取和鑒定方法一致。

    利用比單細胞更小的毛細管管徑對亞細胞區域進行提取和鑒定是毛細胞管電泳的一大特色，也是離傳統意義單細胞最接近的技術手段。

    毛細管電泳-質譜需要面臨仍然有很多問題：CE與質譜接口的穩定性、重復性、電泳吸附時面臨損耗，未來單細胞之路實現簡單、容易操作的標準化還是需要不斷更新和探索。

2．單細胞蛋白質組之基于液相色譜的分離

    對于毛細管電泳來說，液相色譜中的納升液相色譜（nanoLC）其重現性、nL級別的進樣、超低的流速（nL/min）、較少的樣品損失等特點在單細胞蛋白質組學的應用范圍更廣。

    Sun等利用納升液相色譜的反相分離模式研究了非洲爪蟾早期胚胎的囊胚細胞，單次實驗從16細胞分裂階段的細胞中鑒定1400多個蛋白，通過比較不同階段蛋白質的表達情況，證實了隨著分化程度的不斷加深，囊胚細胞間的異質性逐漸增強。

    Slavov課題組發展一種基于LC分離的單細胞蛋白質定性以及相對定量方法-單細胞蛋白組學質譜（SCoPE-MS）。

    該方法首先在顯微鏡下將單個Hela細胞挑選至玻璃管中，經過超聲破碎、過夜酶解等蛋白質前處理步驟，利用TMT標記技術對不同細胞間的蛋白質進行相對定量，整個過程中引入載體“carriers”概念，利用單獨的TMT通道進行標記，在于待測細胞混合后同時檢測，載體的存在減少了單細胞表面依附造成的損失，為質譜離子化提足夠的多肽，增加后續肽段的鑒定。

    這一概念為單細胞技術的發展提供了重要參考。為了解決通量的技術，后續改進在純水中冷熱交替實現細胞裂解，引入微孔板進行細胞樣品處理從而提高通量。

Sun等利用納升液相色譜的反相分離模式研究了非洲爪蟾早期胚胎的囊胚細胞

A)爪蟾胚胎顯微照片。B)從胚胎分離的單個卵裂球單細胞蛋白質組學的工作流程

    2018年Nature Communications在線發表“Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells”的研究論文，是由美國華盛頓州國家環境分子科學實驗室的Ryan T. Kelly團隊最新研究成果。

    基于質譜(MS)的蛋白質組學方法大部分需要包含至少數千個細胞的樣本來提供深入的分析，課題采用了基于芯片的納升級微量液滴蛋白處理系統nanoPOTS。

    該平臺nanoPOTS (nanodroplet processing in one pot for trace samples) 可以基于小細胞群體進行蛋白質組學的分析，nanoPOTS可將處理量降低至200nL以下，減少表面損失，提高了樣品的效率和回收率；與超靈敏的液相色譜質譜聯用儀相結合時，nanoPOTS可以從10-140個細胞中鑒定到約1500-3000個蛋白。

NanoPOTS平臺蛋白質組學的樣品制備

NanoPOTS玻璃芯片是用光刻方式制作的親水底座，周圍環繞著疏水表面，作為多步蛋白質組學樣品處理的納米液滴反應容器(納米井)。

芯片玻璃墊片密封在鍍膜的載玻片上，以在各個培養步驟中最大限度地減少納米孔內容物的蒸發。

通過芯片的納升級微量液滴蛋白處理系統nanoPOTS，對細胞和組織沉積到每個腔室中

在腔室中完成樣品的定量、蛋白的提取、烷基化和酶解等過程，最后保存冰箱中或轉移至LC-MS進行后續分析。

nanoPOTS平臺的靈敏性和蛋白質組覆蓋度

1）利用NanoPOTS系統對HeLa細胞的敏感性和的蛋白質組覆蓋率進行測試。

作者分別對10-14 、37-45 和137-141個Hela細胞進行測試，蛋白質的肽段鑒定范圍在7364-17836。

蛋白質的鑒定范圍在1517-3056個。

3）通過Maxquant的MBR的定性分析發現當最小到最大的上樣量時，平均蛋白的識別率增加到3092、3215和3460，并且85%的蛋白是全部樣品所共有的，進一步說明較少的樣品中可以鑒定和定量到更多蛋白質。

    基于液相色譜的單細胞處理體積逐漸降至nL級別，將一系列蛋白質在樣品處理步驟整合在微小的體積中，通過設置密封條件、減少洗滌步驟等方式來降低樣品的損失，進而結合nanoLC-MS進行分離和檢測。

    對于細胞裂解過程、蛋白前處理是否高效、是否對肽段標記等步驟仍然等是影響單細胞蛋白鑒定數目和種類的重要因素

    無論是采用哪種原理實現標準化、應用廣泛的單個細胞的蛋白質組仍有很多困難要克服，隨著單細胞蛋白質組檢測的靈敏度、蛋白覆蓋度、細胞通量、空間分辨率等技術的優化，相信單細胞蛋白質組學在解決基礎科研和臨床轉化問題的應用會更加廣泛。

前沿綜述 | 單細胞-蛋白組分析技術及其應用

以蛋白質組為目標的單細胞分析技術有哪些？它們有哪些應用？

來自加拿大的研究團隊在《Nature reviews chemistry 》發表了單細胞蛋白組技術相關的綜述，回顧了單細胞蛋白組分析技術，并評估其優勢和局限性。所介紹的新興技術有可能揭示對腫瘤異質性和治療耐藥性的新見解，闡明免疫反應和免疫療法的機制，并加速藥物的發現。

單細胞蛋白組分析工具

    目前還沒有在單細胞水平上進行全蛋白組分析的工具可供商業使用，但已經開發了幾種技術用于高復用蛋白分析。最廣泛使用的方法有：基因編碼熒光蛋白與高分辨率成像相結合；基于抗體的策略與流式細胞術或微流控技術相結合；以及質譜技術。

用于蛋白分析的熒光探針

    GFP是一種基因編碼的報告基因，由于熒光蛋白具有良好的生物相容性，在大量的單細胞蛋白質分析研究中，人們利用基因轉染技術將熒光蛋白與目的蛋白連接起來。毛細管電泳（CE）是一種很有前途的單細胞分析細胞質蛋白的工具。在熒光團的光轉化過程之后檢測熒光的遠場成像方法，例如光激活定位顯微鏡，揭示了RAS的二聚依賴性信號機制。

    但實現熒光蛋白融合文庫的分析方法受到讀出次數的限制，讀出次數受可用熒光團的光譜重疊的限制，并且如果熒光蛋白和宿主蛋白之間的連接體不夠長且不穩定，則可能發生對天然蛋白功能的潛在阻礙。此外，這些蛋白對于應用樣本也有限制，其跟蹤時間不能超過它們的光漂白點，這限制了它們在長時間尺度實驗中的應用。

基于抗體的蛋白分析

    基于抗體的單細胞蛋白檢測可以與顯微鏡、流式細胞術或微流控平臺相結合，生成高通量的數據集。1）顯微技術，如免疫細胞化學和免疫組織化學，是最簡單的單細胞蛋白質檢測，可以提供單細胞分辨率的蛋白質定位的空間信息；2）流式細胞術，熒光激活細胞分選（FACS）是最成熟的蛋白分析方法，其通常用于分析和分類活細胞，對于分離特定的細胞表型以進行后續的下游分析非常有用。流式細胞術的一個主要缺點是在制備過程中細胞間失去接觸。此外，細胞受到機械剪切力的作用，這種剪切力可改變細胞內的信號傳遞行為；3）通過飛行時間進行細胞計數，飛行時間質譜流式細胞術（Cytometry by time of flight，CyTOF）是分析細胞表面和細胞質蛋白的最先進技術之一，其還可用于分析固定組織，從而為免疫組化分析提供了一個強有力的選擇。這項技術還可以與免疫細胞化學和免疫組織化學方法相結合，以亞細胞分辨率同時成像多達32種蛋白和蛋白質修飾。CyTOF還可以促進高維單細胞CRISPR篩選。然而，CyTOF不能對活細胞進行分類。其他缺點包括商業金屬同位素標記抗體的有限可用性以及與大數據集的質量控制和分析相關的挑戰。由于回收率不是100%，因此CyTOF也很難用于小細胞集的單細胞水平檢測。4）微流控平臺，基于微流控技術的單細胞蛋白質測量工具包括液滴微流控技術、微刻方法、單細胞條形碼芯片（SCBCs）、單細胞Western印跡和磁排細胞儀（MagRC）。這個領域非常活躍，正在產生許多新的系統。

質譜技術

    質譜在蛋白質組學中取得成功的根本原因在于其固有的特異性和理論上延伸到單一離子的高靈敏度。盡管目前的質譜分析方法在靈敏度和細胞通量方面受到限制，但使用液滴微流體將樣品體積從微升減少到納升無疑可以提高其分析性能。目前，質譜法普遍用于蛋白分析。

單細胞的蛋白組+轉錄組分析

    將蛋白組學和轉錄組學分析整合到單一的多組學方法中提供了在單個細胞中檢測RNA表達和蛋白質豐度的動力學可能性，這反過來可能產生對復雜調控過程的機制性見解，例如表觀基因組、轉錄和轉錄后基因監管。此外，同步的mRNA和蛋白質分析可用于確定mRNA和蛋白質水平在活躍的轉錄后調控期間相關性較差的細胞狀態。

    最直接的分析蛋白質水平和RNA表達的方法是使用單個細胞的索引FAC同時測量同一細胞中的少量蛋白質和相應轉錄物的水平。另一種方法依賴于鄰近延伸分析（PEA）與RNA分析并行進行蛋白檢測。

    鄰近連接分析（PLA）依賴于兩個抗體結合的寡核苷酸在同一蛋白質靶點上的連接而不是雜交。這種方法被用來研究蛋白質-蛋白質相互作用的亞細胞定位，例如RNA的PLA在mass-cytometry工作流程中實現，以便能夠同時定量單個原代人類外周血單個核細胞中的10個轉錄物和相應蛋白質。

    通過測序、RNA表達以及蛋白測序分析對轉錄組和表位進行細胞索引的兩種方法利用與DNA條形碼結合的抗體，以便能夠在單細胞水平上同時分析細胞表面蛋白質和mRNAs。CyTOF與單細胞RNA測序相結合可以追蹤樹突狀細胞（DC）譜系的發育。

    可以想象，將單細胞蛋白組學方法與多組學工具相結合，可以促進我們對細胞過程的理解，特別是對癌癥抵抗機制和治療反應多樣性的理解。

單細胞蛋白組學工具的應用

了解腫瘤異質性和治療耐藥性

    病理學家早就認識到許多蛋白質在腫瘤細胞中的不均勻表達。例如大多數B細胞惡性腫瘤患者用靶向CD19的嵌合抗原受體T細胞治療。這些患者最初對治療有反應，但約30%的患者復發，因為腫瘤細胞表達由選擇性剪接產生的CD19亞型，并且缺乏編碼抗原表位的外顯子。在這些情況下，單細胞蛋白質組學工具可用于全面研究治療性耐藥的機制——無論是預先存在的和/或獲得性的——并因此采取更有效的治療策略。

癌癥免疫治療

    單細胞蛋白分析已被用于表征T細胞亞型及其祖細胞，以及它們在不同免疫療法誘導下對癌癥的反應。此外，單細胞蛋白質組學結合T細胞受體鏈和配對新抗原的DNA測序提高了我們對這種配對的認識，并指導了一些癌癥免疫治療策略。單細胞蛋白分析方法也支持了采用性細胞轉移方法的進展。

高通量藥物篩選

    高通量藥物篩選能夠全面評估生物活性分子對單個人細胞的影響，可以為臨床前開發提供有價值的指標，并最終基于對患者細胞表型的離散性知識指導治療選擇。例如CyTOF可以通過對每個細胞進行條形碼編碼來評估藥物庫對具有深維度的單個細胞的影響、每個細胞具有獨特的質量特征、報告其位置和每種藥物的測試劑量。

    隨著單細胞蛋白質組學技術的不斷發展和成熟，每個細胞可以測量的參數數量和分析的細胞數量都將繼續增加。單細胞蛋白組學和相關數據分析的未來發展可能會成為擴大和完善單細胞多組學方法所需的關鍵基石，使我們能夠建立一個全面的人類細胞圖譜，包括人體的每一個細胞，以及關鍵模型生物的配套圖譜。雖然目前可用的工具正在為復雜的生物現象提供前所未有的可視化和分辨率，但還是需要下一代的單細胞檢測來提供更廣泛的蛋白質組覆蓋面。

參考文獻

Labib, M., Kelley, S.O. Single-cell analysis targeting the proteome. Nat Rev Chem 4, 143–158 (2020). https://doi.org/10.1038/s41570-020-0162-7

圖片均來源于參考文獻，如有侵權請聯系刪除。