用雙鏈探針雜交檢測另一個遠緣DNA時,探針序列與被檢測序列間有很多錯配。而兩條探針互補鏈之間的配對卻十分穩定,即形成自身的無效雜交,結果使檢測效率下降。采用單鏈探針則可解決這一問題。單鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:(1) 以M13載體衍生序列為模板,用Klenow片段合成單鏈探針; (2) 以RNA為模板, 用反轉錄酶合成單鏈cDNA探針。
1. 從M13載體衍生序列合成單鏈DNA探針 合成單鏈DNA探針可將模板序列克隆到噬粒或M13噬菌體載體中,以此為模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸為引物, 在[a-32P]-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射標記探針，反應完畢后得到部分雙鏈分子。在克隆序列內或下游用限制性內切酶切割這些長短不一的產物,然后通過變性凝膠電泳(如變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)將探針與模板分離開。雙鏈RF型M13 DNA也可用于單鏈DNA的制備,選用適當的引物即可制備正鏈或負鏈單鏈探針。
材料：已制備好的單鏈DNA模板（方法參見第十章中有關內容）。
設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
試劑：
(1)10×Klenow緩沖液：0.5mol/L NaCl, 0.1mol/L Tris·Cl(pH7.5); 0.1mol/L MgCl2。
(2)0.1mol/L DTT溶液。
(3) [α-32 P] dATP：3000Ci/mmol, 10μCi/μl。
(4)40mmol/L和20mmol/L的未標記的dNTP溶液。
(5)dCTP,dTTP,dGTP各20mmol/L的溶液。
(6) Klenow片段（5單位/ml）。
(7)適宜的限制酶，如EcoRⅠ、HindⅢ等。
(8)0.5mol/L EDTA （pH8.0）。
操作步驟：
(1)在0.5ml eppendorf管中混合如下溶液：
單鏈模板（約0.5pmol） 1mg
適當引物 5pmol
10×Klenow緩沖液 3ml
加水至 20ml
(2)將eppendorf管加熱到85℃ 5分鐘，在30分鐘內，使小離心管降到37℃；
(3)依次加入：
DTT 2ml
[a-32P]dATP 5ml
未標記的dATP 1ml
dGTP,dCTP,dTTP混合液 1ml
混合均勻后，稍離心使之沉于試管底部。
(4)加1ml（5單位）Klenow酶室溫下30分鐘。
(5)加1ml20mmol/L未標記的dATP溶液20分鐘。
(6)68℃加熱10分鐘，使Klenow片段失活。調整NaCl濃度，使之適宜于酶切。
(7)加入20單位限制性內切酶（如EcoRⅠ, HindⅢ等）酶切1小時。
(8)酚/氯仿抽提DNA，乙醇沉淀以去除dNTP或加0.5mol/L EDTA(pH8.0)至終濃度10mmol/L。
(9)用電泳方法分離放射性標記的探針。
2. 從RNA合成單鏈cDNA探針 cDNA單鏈探針主要用來分離cDNA文庫中相應的基因。用RNA為模板合成cDNA探針所用的引物有兩種: (1)用寡聚dT為引物合成cDNA探針。本方法只能用于帶Poly(A)的mRNA,并且產生的探針極大多數偏向于mRNA 3'末端序列。(2) 可用隨機引物合成cDNA探針。該法可避免上述缺點,產生比活性較高的探針。但由于模板RNA中通常含有多種不同的RNA分子,所得探針的序列往往比以克隆DNA為模板所得的探針復雜得多, 應預先盡量富集mRNA中的目的序列。
反轉錄得到的產物RNA/DNA雜交雙鏈經堿變性后,RNA單鏈可被迅速地降解成小片段,經Sephadex G-50柱層析即可得到單鏈探針。 材料：已提純的RNA或mRNA
設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
試劑：
(1)合適的引物：隨機引物或oligo(dT)15-18。
(2)5mmol/L dGTP, dATP dCTP, dTTP。
(3) [a-32P]dCTP(>3000Ci/mmol, 10mCi/ml)。
(4)反轉錄酶(200000單位/ml)。
(5)100mmol/L DTT。
(6)250mmol/L MgCl2。
(7)1mol/L KCl。
(8)0.5mol/L EDTA (pH8.0)。
(9)10% SDS。
(10)RNasin(40單位/ml)。
操作步驟:
(1)在已置于冰浴中的滅菌離心管中加入下列試劑：
RNA或mRNA 10.0ml
合適的產物(1mg/ml) 10.0ml
1mol/L Tris·Cl(pH7.6) 2.5ml
1mol/L KCl 3.5ml
250mmol/L MgCl2 2.0ml
5mmol/L dNTP 10.0ml
[a-32P]dCTP 10.0ml
0.1mol/L DTT 2.0ml
Rnasin 20U
加水至 48ml
反轉錄酶(200000單位/ml) 2ml
混勻后,稍稍離心，37℃保溫2小時。
(2) 反應完畢后加入下列試劑： 0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2ml 10% SDS 2ml
(3) 加入3ml 3mol/L NaOH。68℃保溫30分鐘以水解RNA。
(4) 冷卻至室溫后, 加入10ml 1mol/L Tris·Cl (pH7.4)。混勻。然后加入3ml 2mol/L HCl。
(5) 酚/氯仿抽提后，用Sephadex G-50柱層析或乙醇沉淀法分離標記的探針。 [注意] RNA極易降解，因而實驗中的所有試劑和器皿均應在DEPC處理后，滅菌備用。