博納艾杰爾推出奶粉中雙氰胺的檢測方法

　　原標題：奶粉中雙氰胺的檢測方法 (HPLC-UV和HPLC-MS/MS法)

　　北京時間1月25日凌晨消息，新西蘭牛奶中發現了有害物質——雙氰胺。雙氰胺又名二氰二胺，縮寫DICY或DCD。雖然國際標準未對食品中的雙氰胺限量，但高劑量的雙氰胺對人體是有毒的。

　　本文采用天津博納艾杰爾科技的Cleanert? MAS-QuChERS-雙氰胺凈化管(貨號：MS-DI5001)和Venusil? HILIC液相色譜柱，建立了奶粉中雙氰胺的MAS-QuEChERS快速前處理方法和LC-UV以及LC-MS/MS檢測方法。

　　

　　實驗部分

　　儀器和試劑

　　高效液相色譜儀，渦旋振蕩器，超聲波清洗機，氮吹儀。

　　雙氰胺標準品，Cleanert^? MAS-QuChERS-雙氰胺凈化管，Venusil^? HILIC液相色譜柱，微孔濾膜，乙酸銨、乙酸、乙腈為色譜純，實驗用水為超純水。

　　實驗方法

　　提取、凈化

　　稱取1g試樣于50ml具塞離心管中，加入2ml水溶解后，加乙腈定容至10ml，超聲10min，8000r/min離心5min，取2ml上清液加Cleanert? MAS-QuChERS-雙氰胺凈化管中，，渦旋0.5min，8000r/min離心5min，取上清液過0.22um濾膜，待測。

　　HPLC法：

　　色譜條件：

　　色譜柱：Venusil? HILIC 5μm 100? 4.6*250mm;

　　流動相：A：10mmol/L乙酸銨(pH=4.0);

　　B：乙腈;

　　A：B=10:90;

　　檢測波長：220nm;

　　進樣量：10μl;

　　柱溫：30℃;

　　流速：1ml/min。

　　實驗結果：

　　線性關系和檢出限

　　準確稱取雙氰胺標準品50mg于50ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，作為標準貯備液;

　　分別量取一定量的標準貯備液，用乙腈稀釋，配置成濃度為0.1μg/ml，0.5μg/ml，1.0μg/ml，2.0μg/ml，5.0μg/ml和 10.0μg/ml的標準溶液，按照上述色譜條件，依次進樣檢測。以標準溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，擬合線性方程，結果見表2：

表2 雙氰胺線性方程和定量限(HPLC法)檢測方法穩定性考察

名稱	保留時間	線性方程	相關系數	最低定量限（S/N=10）
雙氰胺	4.92min	Y=116.44X+3.2699	0.9997	0.1μg/ml

　　檢測方法穩定性考察

　　選用10.0μg/ml的標準溶液連續進樣6針，計算其保留時間和峰面積的RSD值，結果見表3：

表3 檢測方法定性和定量穩定性考察考察(HPLC法)準確度和精密度

標號	保留時間，min	峰面積
1	4.930	1061.7
2	4.933	1072.2
3	4.930	1064.4
4	4.929	1079.7
5	4.930	1067.3
6	4.934	1073.6
RSD，%	0.04	0.62

　　準確度和精密度

　　選取市售某品牌奶粉試樣，進行添加回收實驗，結果見表4

表4 10μg/g添加回收實驗結果(HPLC法)LC-MS/MS法：

平行1，%	平行2，%	平行3，%	平均值，%	RSD，%
98.6	88.4	89.8	92.3	5.99

　　LC-MS/MS法：

　　色譜條件：

　　色譜柱：Venusil? HILIC 5μm 100? 2.1*150mm;

　　流動相：A：0.5mmol/L乙酸銨(pH=4.0)

　　B：乙腈

　　A：B=10:90

　　進樣量：10μl;

　　柱溫：30℃;

　　流速：0.2 ml/min。

　　質譜條件

　　質譜儀：API 4000+;

　　離子源：電噴霧離子源;

　　掃描方式：正離子掃描;

　　檢測方式：多反應監測;

　　CAD：8.00;

　　CUR：10.00;

　　GS1：60.00;

　　GS2：50.00;

　　IS：5500.00;

　　TEM：500.00。

表5 雙氰胺質譜信息

藥物名稱	監測離子對	DP	EP	CE	CXP
雙氰胺	85/68	71	10	41	6
	85/43	71	10	41	6

注：帶“____”的監測離子對為定量離子對。

　　實驗結果

　　線性關系和檢出限

　　準確稱取雙氰胺標準品50mg于50ml容量瓶中，加水溶液并稀釋至刻度，作為標準貯備液;

　　分別量取一定量的標準貯備液，用乙腈稀釋，配置成濃度為5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml和500ng /ml的標準溶液，按照上述液質方法，依次進樣檢測。以標準溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，擬合線性方程，結果見下表6：

表6 雙氰胺線性方程和定量限(LC-MS/MS法)檢測方法穩定性考察

名稱	保留時間	線性方程	相關系數	最低定量限（S/N=10）
雙氰胺	3.15min	Y=8777.2X+7435.9	0.9993	5ng/ml

　　選用50.0ng/ml的標準溶液連續進樣6針，計算其保留時間和峰面積的RSD值，結果見表7：

表7 檢測方法定性和定量穩定性考察考察(LC-MS/MS法)

標號	保留時間，min	峰面積
1	3.29	382950
2	3.30	387950
3	3.25	382840
4	3.31	399820
5	3.30	378580
6	3.30	383810
RSD，%	0.65	1.92

　　準確度和精密度

　　選取市售某品牌奶粉試樣，進行添加回收實驗，結果見表8。采用空白樣品稀釋法判斷檢測方法的基質效應影響。空白凈化液稀釋和乙腈稀釋的標準溶液，雙氰胺峰面積和相對豐度比無明顯變化，故判斷該方法無基質效應的影響。

表8 100ng/g添加回收實驗結果

平行1，%	平行2，%	平行3，%	平均值，%	RSD，%
84.6	80.7	90.2	85.2	5.61

雙氰胺檢測方法包訂貨信息

產品名稱	規格型號	貨號
MAS-QuChERS-雙氰胺凈化管	100mg/10ml，100支/包	MS-SQA01
Venusil HILIC	4.6*250mm，5μm，100?	VH952505-0
2.1*150mm，5μm，100?	VH951502-0
微孔濾膜	0.22μm，直徑13mm,200/PK	AM021320
雙氰胺對照品	1g/瓶，含量≥99.0%	DCD-0001
離心管	50mL，帶螺紋蓋，25個/包	L050025-C
一次性無菌注射器	5mL,100/pk	ZSQ-5ML

　　附圖

　　

圖1 定性定量穩定性考察譜圖(HPLC法)

　　

圖2 雙氰胺0.5μg/ml標準溶液譜圖(HPLC法)

　　

圖3 奶粉空白譜圖(HPLC法)

　　

圖4 奶粉10μg/g空白譜圖(HPLC法)

　　

圖 5 10ng/ml雙氰胺標準溶液質譜圖

　　

圖 6 奶粉空白質譜圖