原代細胞分離技術

　　取人或動物體內(或胚胎)的組織，將其剪碎至1mm3的組織塊，再采用的如下方法進行分離培養：

　　一、懸浮細胞的分離方法

　　1、將血液、羊水、胸水或腹水等懸液直接轉至離心管中，1000rpm/分鐘離心5分鐘。

　　2、去掉上清，離心沉淀用無鈣、鎂的PBS清洗后1000rpm/分鐘離心5分鐘。此步重復兩次。

　　3、用培養基重懸，調整適當細胞濃度后分瓶培養。

　　4、如選用懸液中某種細胞，可采用離心后的細胞分層液收獲目的細胞。

　　二、實體組織材料的分離方法

　　(一)機械分散法

　　1、纖維成分很少的腦組織，部分胚胎組織，用剪刀剪碎至1mm3的組織塊。

　　2、用PBS清洗兩次后

　　①用吸管吹打，分散組織細胞。

　　②或將已充分剪碎分散的組織放在注射器內(用九號針)，使細胞通過針頭壓出。

　　③或在不銹鋼紗網內用鈍物(注射器鈍端)壓擠使細胞從網孔中壓擠出。

　　3、收集細胞轉入離心管中，1000rpm/分鐘離心5分鐘。

　　4、去上清，加入含血清的培養基，重懸后移至培養瓶中培養。

　　(二)消化分離法

　　1、酶消化分離法(過夜冷消化法)

　　①細胞間質較少的軟組織，如肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等，用Hanks液清洗組織三次，剪成碎塊大小為4毫米左右。

　　②再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪組織。

　　③加入0.25%的胰蛋白酶，搖勻后放4℃過夜。

　　④次日再用Hanks液洗滌，棄去上清，共洗2-3次。

　　⑤加入少量含血清的培養基吹打分散，細胞計數，按適當的濃度分瓶培養。

　　2、非酶消化法(EDTA消化法)

　　①把組織塊剪碎，呈1mm3大小的組織塊。

　　②將碎組織塊在平皿中用無鈣鎂PBS洗2-3次。

　　③加入消化液(胰蛋白酶或膠原酶或EDTA)于37℃水浴中作用適當時間(中間可輕搖1~2次)，若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續消化直至膨松絮狀為止。

　　④棄去上清，加入含有鈣、鎂離子的培養基中止消化反應，并洗滌2-3次后，加入完全培養基。

　　⑤用吸管吹打，使細胞充分散開后用紗網過濾后分瓶培養。