雙熒光素酶實驗是廣大科研工作者經常會遇到的實驗。雙熒光素酶報告基因通常以螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）為報告基因，以海腎熒光素酶（Renilla luciferase）為內參基因。這樣構建的報告系統具備很多優勢，包括檢測靈敏度高、動態范圍廣、應用靈活等。同時雙熒光素酶實驗也有很多應用比如蛋白與蛋白互作，miRNA靶基因驗證，轉錄因子調控驗證，ceRNA研究等多種研究。
為了研究特定基因的轉錄調控元件，可以將這些元件插入到含有螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）的表達載體中，從而創建一個報告基因質粒。這使得所研究的序列能夠調節熒光素酶基因的表達。接著，通過將這個報告基因質粒轉入細胞，并對細胞施加不同的實驗處理，可以分析這些調控元件的功能。處理后，細胞被裂解，并加入熒光素底物（luciferin），此時熒光素酶能催化熒光素產生熒光（主峰波長約為560nm）。通過測量熒光強度，可以評估不同處理對這些轉錄調控元件的影響。
為了消除因質粒轉染效率差異而引起的實驗誤差，常常會同時引入Renilla熒光素酶基因的報告基因質粒作為內部對照（其熒光主峰波長在465nm左右），形成一個雙熒光素酶報告系統。這種方法可以提供更準確和可靠的實驗數據。
熒光素酶實驗的發光機制
熒光素酶是一種在自然界發光生物體內發現的酶，負責催化熒光素（luciferin）或脂肪醛（firefly aldehyde）進行氧化反應以產生光。這類酶在多種發光生物中存在，包括熒火蟲、發光海星、發光節蟲、發光魚和發光甲蟲等。由于細菌熒光素酶對溫度敏感，其在哺乳動物細胞中的應用受到一定限制。目前，廣泛應用于各種研究的是源自北美螢火蟲（photinus pyralis）的熒光素酶基因，它編碼一個由550個氨基酸組成的熒光素酶蛋白，這是一個61Kda的單體酶，無需進行表達后修飾即可表現完全的酶活性。
發光機制:
生物體的發光機制本質上是一種化學發光過程。在ATP、Mg2+和O2的協助下，螢火蟲熒光素酶催化D2熒光素（D2 luciferin）進行氧化脫羧反應，產生激活狀態的氧化熒光素，并伴隨著光子的釋放，從而發出550-580nm波長范圍內的熒光。化學反應式如下：
螢光素酶實驗步驟
1、構建載體：在報告基因質粒的制備中，將目標序列插入帶有熒光素酶的報告基因載體，例如pGL3-basic。
2、轉染質粒：將制備的報告基因質粒與phRL-TK（作為內部參照）一同轉入細胞中。根據實驗的需求對細胞進行相應處理。在共轉染過程中，由于內參質粒含有強效啟動子，通常報告基因質粒與內參的比例約為10:1到50:1。
3、細胞裂解：使用PLB裂解液（Passive Lysis Buffer）進行細胞裂解，該溶液能有效裂解培養的哺乳動物細胞，無需刮取細胞或進行凍融循環，同時最大限度地保持熒光素酶活性并降低自發光，從而提高實驗的靈敏度，適用于低水平的海洋腔腸熒光素酶的定量。
4、底物添加：制備LAR II（螢火蟲熒光素酶的底物）和Stop&Glo（海洋蟲熒光素酶的底物），后者能夠終止LAR II的反應。
5、熒光檢測：使用熒光發光儀進行檢測。
6、數據分析：首先計算每個樣本的螢火蟲熒光素酶與海洋蟲熒光素酶的比值，然后以對照組的比值作為基準1，從而計算不同實驗組的相對熒光素酶活性，這反映了不同處理對基因轉錄調控的影響。
螢光素酶實驗具體應用
1、microRNA與mRNA的相互作用驗證：將目標基因的3'UTR區域克隆到熒光素酶報告基因載體中，然后將其與相應的microRNA一起轉染入細胞。如果熒光素酶的活性降低，這表明該3'UTR可能是microRNA的靶點。
2、microRNA與lncRNA的靶向互作驗證：把待研究的lncRNA序列插入到報告基因載體的3'UTR部分，并監測熒光素酶活性的變化。
3、啟動子的結構分析：通過將約2千堿基對左右的啟動子區域進行切割或突變，并將其插入到熒光素酶報告基因載體中，來分析不同片段對熒光素酶活性的影響。
4、啟動子SNP分析：對于存在單核苷酸多態性（SNP）的基因啟動子區域，可以使用熒光素酶報告系統來評估它們的相對活性。
5、信號通路激活驗證：將特定信號通路的下游組分序列克隆到報告基因載體中，通過測量不同上游條件下熒光素酶活性的變化來評估該信號通路的反應情況。
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