反義技術——RNA干擾（RNAinterference，RNAi）

最近由于RNA干擾（RNA interference，RNAi）的發現使反義領域的研究增多。這種自然發生的現象最早是在秀麗線蟲中發現的（1），是序列特異性地使轉錄后的基因沉默的有力機制。由于最近兩年在RNAi領域取得的進步，已經有許多這方面的綜述發表（2-4）。RNA干擾是由長的雙鏈 RNA分子發動的，該分子可以被Dicer enzyme加工成長度為21-23個核苷酸的RNA（見圖）。RNaseIII蛋白被認為是作為一個二聚體發揮作用，它對雙鏈RNA的兩個鏈都進行切割，酶切的產物3’末端互相重疊。然后這種小的干擾RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）摻入RNA誘導的沉默復合物（RNA- induced silencing complex，RISC），引導核酸酶降解靶RNA。

這種保守的生化機制可用于研究多種模式生物的基因功能，但是它在哺乳動物細胞中的應用受到阻礙，因為長的雙鏈RNA分子會引起干擾素應答。因此Tuschi及其同事表明長度為21nt的 siRNA可以特異性的抑制哺乳動物細胞基因表達是一個革命性的突破（5）。這個發現激發了大量利用RNAi技術對哺乳動物細胞的研究，因為與傳統的反義技術比，RNAi的性能明顯較高。
有趣的是，除了短雙鏈RNA，短發夾RNA（small nuclear RNA，snRNA）比如莖環結構在細胞內經過加工后也可以變成siRNA，從而產生RNA干擾（6、7）。這使得構建表達干擾RNA的載體，從而使哺乳動物細胞內基因表達長期沉默成為可能（4、8）。shRNA可以利用RNA聚核酶III啟動子轉錄，在正常情況下，該啟動子是控制小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）U6（6、7、9、10）或者RNaseP的組分H1 RNA（11）轉錄的。另外一種辦法是兩段短RNA分子分別用U6啟動子轉錄出來（6、12、13）。載體介導的siRNA表達使對功能缺失（loss-of-function）表型進行長期分析成為可能。在穩定轉染的細胞內，兩個月后仍可觀察到沉默現象（11）。

另外一種延長siRNA抑制基因表達時間的方法是對化學合成的RNA進行核苷酸修飾。盡管未經修飾的短雙鏈RNA在細胞培養物或者體內的穩定性出乎意料的高，然而有些情況下，需要對siRNA的穩定性進行進一步提高。因此，可以在兩條鏈的末端都引入經過修飾的核苷（14）。一個5’端為兩個2’-O-甲基RNA、3’端為4個甲基化核苷的siRNA與序列相同但是未經修飾的siRNA比活性相同，但是在細胞培養物中引起的基因沉默現象的時間延長。然而，增多siRNA中的甲基化核苷，或者在核苷中引入體積較大的烯丙基將導致siRNA活性下降。

RNA 干擾在哺乳動物體內的第一個研究是利用快速注射大量生理溶液的方法將一個編碼shRNA的質粒注入老鼠的尾靜脈（15、16）。在大多數器官中，報道基因（編碼于共轉染質粒或者轉基因小鼠上）的表達可以被有效地抑制。另外，Fas基因被作為肝損傷治療相關的內源靶標進行了RNA干擾實驗（17）。注射siRNA之后，小鼠肝細胞中的Fas mRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保護小鼠免遭由注射競爭性Fas特異抗體引起的爆發性肝炎，82%用siRNA 處理的小鼠活過了10天觀察期，而所有的對照小鼠在3天之內死亡。
上述研究中采用的高壓導入技術是一種粗暴的方法，不適于治療用。因此，標準的基因治療所采用的方法被用于RNA干擾。一個反轉錄病毒載體被用于導入siRNA，以抑制人類胰腺腫瘤細胞中的癌基因K-ras等位基因（18）。負調控癌細胞中K-ras基因的表達使得它們在注入無胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成腫瘤的能力。這項研究還表明siRNA的高度特異性，因為只有癌基因K- ras被沉默，而與之只有1個堿基對差異的野生型等位基因并沒有被沉默。另外，當在紋狀區注射表達siRNA的腺病毒之后，轉基因小鼠大腦中GFP基因的表達可以被抑制（19）。β－葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通過在小鼠尾靜脈注射重組腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV啟動子和最小的polyA尾的RNA聚合酶II表達元件被用于這個實驗，為設計組織特異性或者可誘導的siRNA載體打開了大門。

總的來說，siRNA的第一個體內實驗已經進行，其他有重要意義的基因有望于很快作為靶標開展研究。至今為止的研究沒有觀察到任何應用siRNA引起的毒性作用，但是在治療人類疾病的臨床試驗開始之前仍需小心，以排除長期使用RNA干擾引起的嚴重副作用。因為用siRNA使基因表達沉默與傳統的反義技術相似，研究者將從十多年來反義技術研究的教訓中獲益，比如需要使用合適的對照以證明基因表達的敲除是特異性的，以及對免疫系統可能引起的意外影響進行詳細分析。

總結
經過長期盛衰沉浮，反義技術近年來得到越來越多的注意。對能夠提高靶表親和性和生物穩定性、降低毒性的修飾核苷的研究取得了重要進展。由于大多數新的DNA類似物不能激活RNaseH，對反義寡核苷酸的設計需要考慮靶mRNA是否需要保留，例如，是改變剪接方式，還是降解靶mRNA（這種情況下應該使用gapmer技術）。可以通過有系統的修飾天然核酶或者通過體外選擇技術獲得具有高催化活性的穩定核酶。一些反義寡核苷酸和核酶已經進入臨床試驗研究，一個反義藥物已經在1998年獲得批準。一個重要的突破是發現短的雙鏈RNA分子可用于哺乳動物細胞中特異性沉默基因表達。這個方法與傳統的反義技術比效率明顯更高，并且一些體內實驗的數據已經發表。因此，反義技術有望廣泛應用于對未知功能基因的研究、藥物靶標的確認和治療。