葉綠素知識與葉綠素熒光測定的原理（一）

1983年，WALZ公司首席科學家，德國烏茲堡大學教授Ulrich Schreiber博士利用調制技術和飽和脈沖技術，設計制造了全世界第一臺脈沖振幅(Pulse-Amplitude-Modulation，PAM)熒光儀——PAM-101/102/103。

所謂調制技術，就是說用于激發熒光的測量光具有一定的調制(開/關)頻率，檢測器只記錄與測量光同頻的熒光，因此調制熒光儀允許測量所有生理狀態下的熒光，包括背景光很強時。正是由于調制技術的出現，才使得葉綠素熒光由傳統的“黑匣子”(避免環境光)測量走向了野外環境光下測量，由生理學走向了生態學。

經過充分暗適應后，所有電子門均處于開放態，打開測量光得到Fo，此時給出一個飽和脈沖，所有的電子門就都將該用于光合作用的能量轉化為了熒光和熱，此時得到的葉綠素熒光為Fm。根據Fm和Fo可以計算出PS II的最大量子產量Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm，它反映了植物的潛在最大光合能力。

所謂飽和脈沖技術，就是打開一個持續時間很短(一般小于1 s)的強光關閉所有的電子門(光合作用被暫時抑制)，從而使葉綠素熒光達到最大。飽和脈沖(Saturation Pulse, SP)可被看作是光化光的一個特例。光化光越強，PS II釋放的電子越多，PQ處累積的電子越多，也就是說關閉態的電子門越多，F越高。當光化光達到使所有的電子門都關閉(不能進行光合作用)的強度時，就稱之為飽和脈沖。

打開飽和脈沖時，本來處于開放態的電子門將該用于光合作用的能量轉化為了葉綠素熒光和熱，F達到最大值。

在光照下光合作用進行時，只有部分電子門處于開放態。如果給出一個飽和脈沖，本來處于開放態的電子門將該用于光合作用的能量轉化為了葉綠素熒光和熱，此時得到的葉綠素熒光為Fm’。根據Fm’和F可以求出在當前的光照狀態下PS II的實際量子產量Yield=ΦPSII=ΔF/Fm’=(Fm’-F)/Fm’，它反映了植物目前的實際光合效率。

光照狀態下打開飽和脈沖時，電子門被完全關閉，光合作用被暫時抑制，也就是說光化學淬滅被全部抑制，但此時熒光值還是比Fm低，也就是說還存在熒光淬滅，這些剩余的熒光淬滅即為非光化學淬滅。淬滅系數的計算公式為：qP=(Fm’-Fs)/Fv’=1-(Fs-Fo’)/(Fm’-Fo’);qN=(Fv-Fv’)/Fv=1-(Fm’-Fo’)/(Fm-Fo);NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’=Fm/Fm’-1。

在光照下光合作用進行時，只有部分電子門處于關閉態，實時熒光F比Fm要低，也就是說發生了熒光淬滅(quenching)。植物吸收的光能只有3條去路：光合作用、葉綠素熒光和熱。根據能量守恒：1=光合作用+葉綠素熒光+熱。可以得出：葉綠素熒光=1-光合作用-熱。也就是說，葉綠素熒光(葉綠素熒光測定儀)產量的下降(淬滅)有可能是由光合作用的增加或熱耗散的增加引起的。由光合作用的引起的熒光淬滅稱之為光化學淬滅(photochemical quenching, qP);由熱耗散引起的熒光淬滅稱之為非光化學淬滅(non-photochemical quenching, qN或NPQ)。光化學淬滅反映了植物光合活性的高低;非光化學淬滅反映了植物耗散過剩光能為熱的能力，也就是光保護能力。

根據PS II的實際量子產量ΔF/Fm’和光合有效輻射(Photosynthetically Active Radiation, PAR)還可計算出光合電子傳遞的相對速率rETR=ΔF/Fm’·PAR·0.84·0.5。其中0.84是植物的經驗性吸光系數，0.5是假設植物吸收的光能被兩個光系統均分。

當F達到穩態后關閉光化光，同時打開遠紅光(Far-red Light, FL)(約持續3-5 s)，促進PS I迅速吸收累積在電子門處的電子，使電子門在很短的時間內回到開放態，F回到最小熒光Fo附近，此時得到的熒光為Fo’。由于在野外測量Fo’不方便，因此野外版的調制熒光儀(除PAM-2100和WATER-PAM)外，多數不配置遠紅光。此時可以直接利用Fo代替Fo’來計算qP和qN，盡管得到的參數值有輕微差異，但qP和qN的變化趨勢與利用Fo’計算時是一致的。由于NPQ的計算不需Fo’，近10幾年來得到了越來越廣泛的應用。

2常用型號

葉綠素- 分類

葉綠素分為葉綠素a、葉綠素b、葉綠素c、葉綠素d、原葉綠素和細菌葉綠素等。

葉綠素名稱存在場所最大吸收光帶

葉綠素a所有綠色植物中紅光和藍紫光

葉綠素b高等植物、綠藻、眼蟲藻、管藻紅光和藍紫光

葉綠素c硅藻、甲藻、褐藻紅光和藍紫光

葉綠素d紅藻紅光和藍紫光

原葉綠素黃化植物(幼苗期)近于紅光和藍紫光

細菌葉綠素紫色細菌紅光和藍紫光

19世紀初，俄國化學家、色層分析法創始人M.C.茨韋特用吸附色層分析法證明高等植物葉子中的葉綠素有兩種成分。德國H.菲舍爾等經過多年的努力，弄清了葉綠素的復雜的化學結構。1960年美國R.B.伍德沃德領導的實驗室合成了葉綠素a。至此,葉綠素的分子結構得到定論。(手持式葉綠素測定儀)

葉綠素分子是由兩部分組成的：核心部分是一個卟啉環(porphyrin ring)，其功能是光吸收;另一部分是一個很長的脂肪烴側鏈，稱為葉綠醇(phytol)，葉綠素用這種側鏈插入到類囊體膜。與含鐵的血紅素基團不同的是，葉綠素卟啉環中含有一個鎂原子。葉綠素分子通過卟啉環中單鍵和雙鍵的改變來吸收可見光。各種葉綠素之間的結構差別很小。如葉綠素a和b僅在吡咯環Ⅱ上的附加基團上有差異：前者是甲基，后者是甲醛基。細菌葉綠素和葉綠素a不同處也只在于卟啉環Ⅰ上的乙烯基換成酮基和環Ⅱ上的一對雙鍵被氫化。

葉綠素 - 化學性質

高等植物葉綠體中的葉綠素主要有葉綠素a 和葉綠素b 兩種。它們不溶于水，而溶于有機溶劑，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等。葉綠素a分子式：C55H72O5N4Mg;葉綠素b分子式：C55H70O6N4Mg。在顏色上，葉綠素a 呈藍綠色，而葉綠素b 呈黃綠色。按化學性質來說，葉綠素是葉綠酸的酯，能發生皂化反應。葉綠酸是雙羧酸，其中一個羧基被甲醇所酯化，另一個被葉醇所酯化。

葉綠素分子含有一個卟啉環的“頭部”和一個葉綠醇的“尾巴”。鎂原子居于卟啉環的中央，偏向于帶正電荷，與其相聯的氮原子則偏向于帶負電荷，因而卟啉具有極性，是親水的，可以與蛋白質結合。葉醇是由四個異戊二烯單位組成的雙萜，是一個親脂的脂肪鏈，它決定了葉綠素的脂溶性。葉綠素不參與氫的傳遞或氫的氧化還原，而僅以電子傳遞(即電子得失引起的氧化還原)及共軛傳遞(直接能量傳遞)的方式參與能量的傳遞。

卟啉環中的鎂原子可被氫離子、銅離子、鋅離子所置換。用酸處理葉片，氫離子易進入葉綠體，置換鎂原子形成去鎂葉綠素，使葉片呈褐色。去鎂葉綠素易再與銅離子結合，形成銅代葉綠素，顏色比原來更穩定。人們常根據這一原理用醋酸銅處理來保存綠色植物標本。 葉綠醇是親脂的脂肪族鏈，由于它的存在而決定了葉綠素分子的脂溶性，使之溶于丙酮、酒精、乙醚等有機溶劑中。由于在結構上的差別，葉綠素a呈藍綠色，b呈黃綠色。在光下易被氧化而退色。葉綠素是雙羧酸的酯，與堿發生皂化反應。

葉綠素不很穩定，光、酸、堿、氧、氧化劑等都會使其分解。酸性條件下，葉綠素分子很容易失去卟啉環中的鎂成為去鎂葉綠素。葉綠素溶液能進行部分類似光合作用的反應，在光下使某些化合物氧化或還原。人工制備的葉綠素膜在光下能產生光電位和光電流，也能催化某些氧化還原反應。

葉綠素 - 光和作用

光合作用是指綠色植物通過葉綠體，利用光能，把二氧化碳和水轉化成儲存著能量的有機物，并且釋放出氧的過程。光合作用的第一步是光能被葉綠素吸收并將葉綠素離子化。產生的化學能被暫時儲存在三磷酸腺苷(ATP)中，并最終將二氧化碳和水轉化為碳水化合物和氧氣。