哈佛學者開發出下一代基因編輯技術，無需DNA雙鏈斷裂，實現精準、多功能基因編輯

　　這項研究開發了一種新型基因編輯技術——點擊編輯，使用HUHe介導的共價clkDNA定位到DDP的目標位點，從而實現精確和通用的基因組寫入。

　　哈佛醫學院和麻省總醫院的 Benjamin Kleinstiver 團隊在 Nature Biotechnology 期刊發表題為：Click editing enables programmable genome writing using DNA polymerases and HUH endonucleases 的研究論文。

　　該研究開發了一種名為點擊編輯（Click editing，CE）的新型基因編輯技術，將HUH核酸內切酶（HUHe）、DNA依賴的DNA聚合酶（DDP）和RNA引導的Cas9切口酶（nCas9）結合，能夠從簡單的DNA模板進行可編程的精確基因組工程，包括對基因組的替換、插入和刪除，這一研究成果為下一代基因編輯技術的開發指明了新方向。

　　近期，已有研究開發出既能改變DNA序列，又不產生DNA雙鏈斷裂（DSB）的基因編輯技術，例如劉如謙團隊開發的堿基編輯（Base editing，BE）和先導編輯（Prime editing，PE），但堿基編輯系統容易產生不必要的脫靶編輯，且只能編輯單個堿基，而先導編輯系統則存編輯效率偏低、pegRNA設計復雜等缺點。

　　與其他類型的基因編輯器相比，該研究開發的基于DNA依賴的DNA聚合酶（DDP）的基因組編輯技術展現出無與倫比的潛力。DDP在細胞中普遍存在，可能在幾乎任何類型的細胞中都具有酶活性，并且具有高親和力、高保真聚合等優點。此外，DDP與廣泛使用的、臨床驗證的和用戶可指定的DNA寡核苷酸模板兼容，這可能在簡單、可擴展性、可定制性、化學穩定性和編輯純度方面具有優勢。

　　在這項最新研究中，研究團隊設想將DDP融合或招募到DNA切口酶（nCas9）可能會創建一類與之前方法不同的基因編輯技術。研究團隊推測，使用單鏈DNA（ssDNA）招募結構域可以實現修飾編碼模板的定位，從而提高編輯效率。

　　ssDNA模板應當由三個部分組成：1） 與核酸酶蛋白或多肽結合的識別序列；2）實現編輯替換的聚合模板（PT）；3）與靶位點的切割非靶鏈（NTS）具有同源性的引物結合位點（PBS）。

　　理想的ssDNA招募結構域應該對ssDNA模板具有特異性，編碼序列較小，催化融合蛋白-DNA復合物的動力學快速，并且不需要任何專門的修飾。HUH核酸內切酶（HUHe）是滿足這些標準的蛋白質家族。HUHe是一類小蛋白，在絕大多數物種中均有分布，并且執行各種ssDNA特異性活動，包括ssDNA病毒復制、偶聯和轉座等。

　　基于上述這些設想，研究團隊開發了點擊編輯器（Click editors），其中的nCas9能夠在向導RNA（gRNA）的引導下靶向目標基因組位點并產生切口，HUH核酸內切酶（HUHe）將編碼所需編輯的點擊DNA（click DNA，clkDNA）模板共價連接到切口位點的基因組DNA上，然后，DNA依賴的DNA聚合酶（DPP）利用這些模板精確地引入基因編輯。

　　不僅如此，使用未修飾的DNA分子作為點擊DNA（clkDNA）模板的簡單性，允許通過不同的參數快速優化編輯效率，包括編輯類型和額外的沉默突變。此外，clkDNA可以進行高通量篩選，而無需繁雜的分子克隆步驟。

　　點擊編輯系統在組成上是模塊化的，可以使用各種DDP或HUHe結構域，具有進一步優化和工程化改造的潛力。通過對點擊編輯及其clkDNA的模塊化組件的迭代優化，研究團隊證明了在多種永生化人類細胞類型和原代成纖維細胞中以最小插入或缺失突變的情況下進行精確基因組編輯的能力，且精確編輯效率高達30%。

　　更重要的是，點擊編輯系統可以實現多種類型的編輯，包括堿基替換、DNA短片段插入或刪除，在可編程、通用性和精確度等方面表現優異，并且不產生DNA雙鏈斷裂（DSB），不依賴于同源定向修復（HDR），還能適用于各種生物應用。

　　總的來說，這項研究開發了一種新型基因編輯技術——點擊編輯，使用HUHe介導的共價clkDNA定位到DDP的目標位點，從而實現精確和通用的基因組寫入。這一結果突出了DDP在基因編輯技術的應有優勢，點擊編輯系統的模塊化和通用性使其可應用于廣泛物種，并可作為各種應用的通用工具繼續開發和優化，從而為基因編輯領域開辟了新的研究方向。