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一、材料與設備
所有的試劑應該用高質量的高壓滅菌水配制，例如 Milli Q（Millipore，Bedford，MA，USA）純化或雙蒸餾水。所有化學試劑應該是超純級別的或專門用于分子生物學制備的級別。由于體外剪接分析涉及 1015 摩爾級的 RNA，應該特別小心，以避免核糖核酸酶污染。
1. 前體 mRNA 底物
底物由線性化質粒體外轉錄制備，將目的基因或它的一部分克隆到質粒的噬菌體啟動子下游，通常采用的噬菌體
RNA 聚合酶是從 SP6，T7 和 T3 噬菌體中分離而來的。含有帽子結構的前體 mRNA 比不帶帽的前體 mRNA
分子更加穩定，而且剪接更加有效。制備含有帽子的前體 mRNA 底物最方便和有效的方法是用二核苷酸引物（7mGpppG 或者 GpppG）進行轉錄。在轉錄反應中通常采用一種，特定情況下使用兩種或多種 32P
標記的核苷酸，使轉錄合成的前體 mRNA 分子獲得均一標記。轉錄的前體 mRNA 用苯酚抽提并用乙醇沉淀純化，RNA
的產量和濃度根據放射性標記來測定，如采用三氯乙酸 ( TCA ) 沉淀法測定。由于噬菌體 RNA
聚合酶對其啟動子的識別呈高度特異性，轉錄后通常不需凝膠純化。但是如果特定模板產生不均一的轉錄物時，全長的前體 mRNA
應該用制備性變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。
2. 試劑
(1) 25X ATP/CP 混合物：12.5 mmol/L ATP，0.5 mol/L 磷酸肌酸（CP）。每份分裝于微量離心管中，于 -20℃ 儲存。
(2) 80 mmol/L 高純度級的 MgCl2 配制 1 mol/L 儲備溶液，稀釋以制備工作液，每份 0.2 ml 分裝于微量離心管中，儲存于 4℃ 或者 -20°C。
(3) 0.4 mol/L HEPES-KOH（pH 7.3），用 0.2 μm 過濾器過濾除菌并儲存于 4°C。
(4)
13%（m/V）聚乙烯醇 ( PVA )。應選用低分子質量 PVA ( Signia，p-8136 )，為了便于溶解，用 Miili-Q
水在一個帶帽的玻璃瓶中懸浮 PVA，并高壓火菌 10 min，以毎份 1 ml 分裝到微量離心管并儲存于 -20°C。
(5) 剪接終止溶液：0.3 mol/L 乙酸鈉（pH 5.2)，0.1% ( m/V) SDS，62.5 μg/ml tRNA。儲存于室溫或 4℃。
(6) Tris-HCl 飽和酚（pH 8.0）。
(7)
RNA 上樣液：90%（V/V）甲酰胺，50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5)，1 mmol/L
EDTA，0.1%（V/V）溴酚藍，0.1% ( m/V ) 二甲苯藍 FF。以每份 1 ml 分裝在微量離心管中并儲存于 -20℃。
(8)
丙烯酰胺-尿素凝膠儲存溶液：19%（m/V）丙烯酰胺，1%（m/V）甲叉雙丙烯酰胺，7 mol/L 尿素，89 mmol/L Tris
堿，89 mmol/L 硼酸和 2 mmol/L EDTA。將這個儲備溶液用僅缺丙烯酰胺的相同溶液稀釋到工作濃度（通常 4%~10%
丙烯酰胺），升溫到 37℃，并且在與過硫酸銨（每 20 ml 加 10% 過硫酸銨 133 μl ) 和 TEMED ( 每 20 ml 加
10 μl）聚合之前真空脫氣。所用丙烯酰胺的濃度根據所需剪接產物的大小來決定，較高的丙烯酰胺濃度可使套索 RNA（lariat RNA，RNA
剪接過程中的中間產物）分子比較長的線形前體 mRNA
分子遷移得慢，這便于中間產物和產物中套索分子的鑒定并提高靈敏度，因為套索分子的遷移率比在長時間放射自顯影曝光中觀察到的降解 RNA 分子的要慢。
二、操作方法
1. 體外剪接反應
(1) 在置于冰上的離心管中加入新鮮配制的剪接緩沖混合物：1.0 μl 25X ATP/CP 混合物，1.0 μl 80 mmoI/L MgCl2，1.25 μl 0.4 mol/L HEPES-KOH ( pH 7.3 )，5.0 μl 13% PVA ( 最后加），20 fml（通常 0.1~0.4 μl ）32P 標記的前體 mRNA，加 Milli-Q 水至 10 μl。13% PVA 很黏，應該最后加并用 P-20 吸頭上下吹打以輕輕混合，避免產生泡沫。混勻后瞬時離心（約 3 s）。
(2) 解凍足夠量的冷凍 HeLa 細胞核剪接提取物。提取物在室溫下解凍并立即置于冰上，未用完的提取物可在 -70℃ 儲存，反復凍融一般不會導致剪接活性喪失。
(3)
剪接反應。將實驗用離心管置于冰上，小心吸取 15 μl 緩沖液 D 透析的 HeLa 細胞核提取物 ( 或者緩沖液 D 中的 S100
提取物加 SR 蛋白）。根據提取物的量和濃度，有效的剪接通常需要核提取物或者 5~10 μl 核提取物或者 5~10 μl S100 提取物加
15~20 pmol 的 SR 蛋白。加 10 μl 剪接緩沖液混合物，使用新吸頭并用 P-20 吸頭上下吹打（不要振蕩）輕輕混合所有的試劑。
(4) 瞬時離心（大約 3 s)，并于 30℃ 溫育 1~4 h。剪接效率依特定前體 mRNA 而定。
(5) 加 0.2 ml 的剪接終止溶液。
(6) 加 0.2 ml 的 Tris-飽和酚并立即振蕩 1~2 min。
(7) 離心 5 min，將水相轉移到一新離心管中。避免帶入有機相和中間相的物質，以免造成污染。
(8) 加 0.5 ml 的乙醇并振蕩。置冰上或者冷凍至少 10 min，如果需要的話可以儲存過夜。
2. 變性 PAGE 分析剪接產物
15~20cmX15~20cm 的小尺寸凝膠適合于常規的剪接分析，如果要分離多種大小相近的 RNA 應使用較長的凝膠。厚度小于 0.5 mm 的薄凝膠放射自顯影時條帶較銳利。
(1) 將1 “體外剪接反應” 中制備的乙醇沉淀的 RNA 離心 15 min，小心去除乙醇而不要攪動沉淀。如果乙醇已徹底去除，就不用進行干燥。
(2) 加入 3~4 μl RNA 上樣液，使用移液器上下吹打或振蕩使 RNA 沉淀溶解。
(3) 在 80~85℃ 加熱 5~10 min。
(4) 變性聚丙烯酰胺凝膠應該在加樣品之前預電泳至少 30 min。在上樣前用注射器清洗凝膠的加樣孔以去除擴散到孔中的尿素，將加熱后的樣品直接（不冷卻）加載到各個孔中。
(5) 電泳，直到指示劑遷移至所需距離。
(6) 電泳結朿后拆除電泳裝置，在凝膠之上放張用過的 X 射線片或者 3 MM 紙，并輕輕用力使凝膠牢固地粘在上面。將玻片翻過來，慢慢從一邊拿起玻片，確保凝膠粘在膠片或紙上。用干凈的 X 射線片覆蓋凝膠上。
(7) 放射自顯影通常在 -70℃ 進行，并用增感屏。曝光時間通常從 2 h 到整夜，依 RNA 的標記活性而定。
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