哺乳動物細胞瞬時基因轉移法制備重組蛋白實驗

實驗步驟

一、轉染方法

對于脂質體轉染 (Upofection), 可以從商業途徑獲得許多配方，這些配方都具有單一的ZL化組分，而且毫無疑問，它們中的大部分都能非常有效地將質粒 D N A 轉 人 細 胞 。其缺點是價格不菲—- 在使用這些試劑時，對于超出數百毫升規模的瞬時轉染，經濟上是不可行的。大規模的瞬時轉染方法要求轉染試劑能很容易大量獲取, 批次間的變化小以保證轉染的一致性。盡管也存在一些其他的選擇，如將殼聚糖 (chitosan) 及其衍生物和14D E A 2 作為轉染試劑（D a n g and L e o n g , 2006; Jiang and Sharfstein， 2008; K u s u m o t oet a L ， 2 〇〇 6)，但磷酸鈣（calcium phosphate) 介導的轉染以及基于聚乙烯亞胺 (polyethylenimine，PEI) 的質粒絡合 (plasmidcomplexation) 和細胞攝人是僅有的滿足這些要求的兩種常用技術。

1.利 用 聚 乙 烯 亞 胺 在 W a v e ? 生物反應 器 中 進 行 大 規 模 瞬 時 轉 染

近些年 ，一 次 性的 W a v e ? 生物反應器得到了普遍的認可，因為相對于經典的攪拌釜反應器，其保養和操作更加容易。雖 然 100 L 工作體積的反應器也實現了商業化，擁有300 L 工作體積的樣機也在開發之中, 但最常用的反應器的工作體積是 10 L 和 20 L 。是否 使用 W a v e ? 生物反應器進行 10 L 以下的轉染取決于經濟可行性—我們更傾向于使
用搖瓶進行小規模的生產 ( F e m b a c h flasks， Corning)。據報道，也有其他的反應器或振搖設備成功的用于瞬轉培養（Muller et al. ， 2005; P h a m et aL , 2006; Stettler et al.，2007)。

下面介紹以 H E K 293 T 細胞為宿主，使 用 M 11V 3 無血清培養基 (Novartis proprietary) 進行 10 L 規模的抗體生產的方法。 抗體的兩條鏈都克隆至同一個表達載體。

(1) 將一個 20 L 的 W a v e ? 袋（Sartorius Stedim Biotech, G 6ttingen， G e r m a n y ) 安裝 到 W a v e ? 工 作 平 臺（W a v e - Bioreactor S P S 5O ) ，并連接到一個 D A S G I P 氣體混合模塊上（D A S G I P ， Juelich， G e r m a n y )。然后，在 袋 中 接 種 4 L H E K 293T 細胞培養物，細胞密度約 為 I.8 X IO⁶ 個細胞/m L 。

(2) 我 們 采 用 了 下 列 過 程 參 數 和 條 件 : 氣 體 流 速 2 〇 L /h ; 混 合 氣 體 包 括 2 1 % ?2 5 % 〇 2、0 % C O 2; 溫度 37°C ; p H 6. 8?7, 4; 搖擺速率 10 r Z m i n; 搖擺角度 7°

(3) 將 10 m g 質 粒 D N A (1 m g /m L ) 與 M 11V 3 培養基混合至終體積為 500 m L , 室溫孵育 10 m i n 。然 后 ，用 0. 22 p m 的 G P E X P R E S S P L U S 濾 膜（Millipore, Billerica,
M A ) 將稀釋后的 D N A 溶液過濾除菌。

⑷ 將 3 〇 m L P E I 溶 液（I m g /m L ) 與 500 m L M l l V 3 培 養 基 混 合 ，室溫孵育10 m i n 。然后 用 0.22um 的 G P E X P R E S S P L U S 濾膜將稀釋后的 P E I 溶液過濾除菌。

注意:P E I 儲存液在使用前是應當無菌的，經過過濾的，分 裝 并 凍 存 于 一 80°C 直至使用。

(5) 接下來，將 P E I 溶液加至 D N A 溶液中，室溫孵育 15 m i n 以形成多聚絡合物。

(6) 無菌條件下，將 D N A -P E I -M 11V 3 混合物加至 W a v e ? 袋中的細胞培養物中, 終體 積 為 5 L 。繼續用下列參數孵育 5?6 h : 氣體流速 M L /h ; 混合氣體包括 2 5 % O 2、〇 %CO₂; 溫度 37°〇 ; 口 1^6.8?7.4; 搖擺速率 1 〇 r/min; 搖擺角度 7°。

(7) 然后，向 5 L M 11V 3 培養基中補加 100 m L R X l 組合補料 (補料含有氨基酸、葡萄 糖 和 谷 氨 酰 胺 ；由 Irvine Scientific， Santa A n a , C A 定 做），無 菌 條 件 下 將 其 加 至W a v e ? 袋的細胞中。在生產期，采 用 如 下 參 數 : 氣 體 流 速 30?40 L /h ; 混合氣體包括3 〇 %?4 〇 % O 2、0 % C O 2; 溫 度 37°C ; p H 6. 8?7.4(用 p H 9.2 的碳酸氫鹽溶液調整，Sigm a Aldrich, B u c h s , Switzerland); 氣體飽和度 6 0 % ?100%; 搖擺速 率 14?18 r/mi. n ; 搖擺角度 7°。

(8) 轉染的細胞在 W a v e ? 生物反應器中培養 10 天 ，以生產抗體。
注 意 : 為了生產重組蛋白，生 產 期 通 常 為 5?7 天 ，但如果目標蛋白質對蛋白酶解敏感 ，這個時間可以縮短。抗體分子的生產時間可延長至 1 0 天 。

(9) 每天取樣，用 V 1 -Cell 細 胞 計 數 設 備（B e c k m a n Coulter) 測定細胞密度和成活率 。用 Bioprofile 400 分析儀 (Labor-Systeme Fliickiger, Switzerland) 測定營養狀態、p H
及氣體飽和度。用 蛋白 A 高壓液相測定 I g G 濃度（圖 15. 1)。

(10) 10 天后，在無菌條件下收集細胞，橫流過濾（cross-flow filtration) (FreseniusFilter P l a s m a F l u x， 0.2 fim) 以 除 去 細 胞 。然 后 將 無 細 胞 的 上 清 液 用 中 空 纖 維 過 濾(hollow fiber filtration)(H e m o f l o w F 10 H P S , Fresenius, Stans, Switzerland, 10 k D acutoff) 的方法濃縮 10 倍 。

(11) 用 Protein A 親和色譜和分子篩色譜對濃縮液進行純化。對上述這些標準方法有多種改進, 這些改進后的方法已經經過測試并發表，其中的一些在下面簡短列出。

① 在 利用 C H O 細胞系進行生產的過程中，通過轉換溫度至 30?32°C 提高表達速率(Backliwal et al. ， 2008a ; Galbraith et al. ， 2006)。

② 用微管解聚劑諾考達唑（nocodazole) 處 理 細 胞 使 其 細 胞 周 期 停 滯 在 G 2/M 期(Tait et a L ， 2004)。

③ 用抑制劑，如丁酸鈉（sodium butyrate)、丙 戊 酸（valproic acid) 處 理 去 抑 制 C H O和 H E K 293 細胞的組蛋白脫乙酰基酶（histone deacetylase) 及 D N A 甲基轉移酶（D N Amethyl transferase) (Backliwal et al. , 2008c)。

④ 對細胞系進行遺傳改造，以阻止凋亡 (apoptosis) 或克服未折疊蛋白質應答 (unfolded protein response,U P R ) 造成的抑制作用（Backliwal et al. , 2008c; Majors et al. ，2007； Tigges and Fussenegger, 2006) ?

結論

正如該領域中已經發表的大量數據所反映的那樣, 過去幾年，就技術發展和產量而言 ，通過瞬時轉染技術制備重組蛋白已經達到了一個令人印象深刻的狀態。不過，盡管有報道指出，利用大規模瞬時轉染技術在生物反應器中生產蛋白質，已能獲得相當高的抗體滴度—大 于 I g / W B a c k l i w a l et al. ， 2008a)，但現在就想用它替換過程繁瑣的構建細胞系方法用于生物治療藥物的生產還為時尚早。我們通過對 1 〇〇多個瞬時轉染表達實驗的觀察表明，對于不同的基因，表達量變動很大: 一般蛋白質的表達量從 I m g / L 到超過170 m g /L ; 抗體的平均表達量為 20?40 m g /L ，但常常分布在兩個極端。毫無疑問, 在表達載體設計、培養條件優化和可能的細胞系改造方面, 我們還需要進一步的技術改進, 但這種方法總體上令人印象深刻的成功證明了這種努力是值得的。

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