噬菌體鋪平板產生噬斑實驗——連續稀釋法

大腸桿菌

麥芽糖培養基

平板微波爐試管加熱器毛細管

1.  在含0.2 %麥芽糖和10 mmol/L MgSO₄的λ肉湯培養基培養大腸桿菌至飽和。加0.3 ml的大腸桿菌培養液到5個8 mmX80 mm的試管里。

在把加有頂層瓊脂培養基的瓶子放到微波爐前一定要松開瓶蓋！

2.  在微波爐解凍狀態下溶化頂層瓊脂培養基，或煮沸水浴15 min。室溫下冷卻瓶子5 min，然后將加有溶化瓊脂培養基的瓶子放于45~50°C水浴。

3.  用SM將噬菌體溶菌液進行連續稀釋（如100倍的稀釋)。加第一個稀釋液0.1 ml到 一只大腸桿菌試管里，再加第二個稀釋液的0.1 ml到另一只試管里，其他依次稀釋。標記好大腸桿菌/噬菌體混合物的試管，以便它們彼此不混淆。將試管放于室溫培養20 min。

4.  將試管移到37 °C水浴或加熱器10 min。從水浴取出試管。

5.  往每一只試管加2.5 ml的頂層瓊脂培養基，輕輕晃動使其混合，將試管內容物倒到平板上。輕柔地傾斜平板使瓊脂糖培養基平鋪到整個平板表面。將平板放于37°C恒 溫箱培養6~12 h。

6.  從一個噬斑不太密集的稀釋平板上用無菌毛細管或牙簽挑選單個噬斑。為了以備噬斑將來使用，用毛細管切下一塊含有噬斑的瓊脂并把它彈到含1 ml的SM的試管里 （或把牙簽尖放到液體里輕輕攪動）。如果需要，計數一個稀釋平板上的噬斑并估計在最初的庫里感染性噬菌體數。

1.  所有與大腸桿菌接觸的材料都應是無菌的。

2.  在把加有頂層瓊脂培養基的瓶子放到微波爐前一定要松開瓶蓋！

3.  最好制備同時符合以下兩個條件的對照平板：沒被感染的大腸桿菌的菌苔和不含細胞的頂層瓊脂培養基。