四氫異喹啉生物堿的精巧生物合成

　　四氫異喹啉生物堿（tetrahydroisoquinoline alkaloids, THIQAs）是一類重要的天然產物，通常在C-1位含有芐基（即芐基異喹啉生物堿，BIAs）或苯基（即苯基異喹啉生物堿，PIAs）并具有顯著的生物活性（圖1）。目前，臨床上已經應用十幾種天然或半合成的THIQAs來治療多種疾病。不過，自然條件下多數THIQAs只存在于各種植物中，提取不易，因此科學家們一直致力于開發其人工合成方法。然而，不對稱催化等化學合成法對映選擇性較差，成本昂貴，無法進行商業規模生產。于是不少科學家將視線轉向生物合成。在天然產物中，四氫異喹啉（THIQ）骨架通過去甲烏藥堿合成酶（norcoclaurine synthases, NCSs）催化的Pictet-Spengler反應進行生物合成（圖2A）。隨著對BIAs生物合成理解的日益深入，在微生物宿主中引入植物的部分或者全部生物合成途徑相關基因，通過生物合成法來生產BIAs已經成為一種可行的策略。相比于化學合成法，這種方法更經濟、操作更簡單，從而更具有吸引力。然而，通過微生物生產植物THIQAs仍然存在許多挑戰，比如：（1）對于PIAs及許多BIAs的生物合成途徑的理解，目前還并不清楚，難以轉移到微生物中，目前有成功報道的也只是少數BIAs；（2）大多數高價值THIQAs都帶有許多取代基，例如在C6、C7、C3'和C4'位置上帶有甲氧基；（3）在微生物中引入植物基因一方面會加大微生物的代謝負擔，另一方面，不少植物酶在微生物系統中表達較差或者活性較低。此外，NCSs的底物范圍窄，難以用于合成多種THIQAs。

圖1. 代表性的THIQAs。圖片來源：Chem. Sci.

　　近日，上海交通大學和武漢大學的瞿旭東教授課題組發展了一種生物催化方法，使用亞胺還原酶（imine reductases, IREDs）和N-甲基轉移酶（N-methyltransferase, NMT）從二氫異喹啉（DHIQ）前體出發合成植物THIQAs（圖2B）。亞胺還原酶IR45的工程化，可顯著擴展其底物特異性，從而可以將1-苯基和1-芐基6,7-二甲氧基-DHIQs高效且立體選擇性地轉化為相應的(S)-四氫異喹啉（(S)-THIQs）。烏藥堿N-甲基轉移酶（CNMT）能夠進一步有效地將這些(S)-THIQ中間體轉化為(S)-THIQAs。通過在一個反應中結合IRED、CNMT和葡萄糖脫氫酶（GDH），他們在大腸桿菌中構建了兩種人工模擬生物合成途徑，并成功地將其應用于5個(S)-THIQAs的合成。這種高效（自DHIQs產率100％）且易于調控（添加其他基因）的生物合成方法適用于生產各種植物THIQAs。相關成果發表在Chemical Science 上。

圖2. 植物THIQA的生物合成法。圖片來源：Chem. Sci.

　　Cryptostyline I、II和III（1-3，圖1）是從植物中分離出的三個有代表性的PIAs，作者選擇它們作為本研究的目標。通過化學合成，以較好的收率（90-91％）得到三種cryptostyline（1-3）的1-苯基-6,7-二甲氧基-DHIQ前體（1a-3a，圖3）。先前的研究表明(S)-IRED IR45對1-苯基-DHIQ具有良好的耐受性，因此選擇該酶用于新底物的活性測定，結果表明IR45能夠有效地將1a還原為(S)-1-亞甲基二氧苯基-6,7-二甲氧基-THIQ（1b，圖2），轉化率為100％，ee 值≥99％（圖4），但它對兩個空間位阻較大的底物2a和3a卻沒有活性。

圖3.本研究中涉及到的DHIQ底物。圖片來源：Chem. Sci.

圖4. IR45及其突變體對1a-5a的轉化率和對映選擇性。圖片來源：Chem. Sci.

　　作者進行了底物1a與IR45的分子對接研究，在IR45結合口袋中，計算模型顯示1a被天冬氨酸（D183）和NADPH緊密包圍（圖5）。其中亞胺鍵的位置靠近NADPH的si-面，這與產物的S-構型一致。從模型中可以看出，右側的裂口是容納亞甲基二氧苯基的主要限制因素（圖5）。然而，對該區域進行酶工程可能會嚴重損害酶的活性和穩定性。因此，作者設想通過突變結合口袋底部的F190和W191殘基，或許可以擴大結合口袋，讓底物進入左腔稍微深一些，從而有可能減少右側裂口與底物2a和3a之間的空間位阻。先前的研究顯示W191在底物結合和維持酶的催化活性構象中發揮著重要作用。隨后將W191進一步突變并對其進行動力學分析，結果表明W191F對酶的催化構象影響最小。接著，作者將W191F頂部的其他19個殘基進行突變，結果顯示突變體F190L-W191F能夠顯著提高2a和3a的活性（24 h內的轉化率分別為75％和100％），并且產物2b和3b的立體選擇性很好（圖2、圖4）。這些結果說明，通過酶工程作者成功地拓寬了IR45的底物特異性，并使有效地將大位阻DHIQ前體轉化為相應的THIQ。

圖5. 底物1a和4a與IR45結合的模型。圖片來源：Chem. Sci.

　　接下來，作者將IR45應用于BIAs的合成。值得注意的是，野生型IR45能夠有效地將DHIQ底物4a和5a轉化為相應的(S)-THIQ（轉化率100％；ee 值> 99％）。最佳突變體F190M-W191F能夠顯著提高對4a和5a的催化活性（圖6）。有趣的是，野生型IR45所不能催化轉化的大位阻底物2a和3a，其平面骨架卻比4a和5a的還要小一些，這有點讓人意外。為了探索酶腔中結合的差異對催化活性的影響，作者進行了4a與IR45的分子對接研究（圖5B）。計算分析表明4a的DHIQ平面與1a的構象相同。不同于1a，4a的芐基向右側裂口下方的大空腔彎曲，這種定位上的差異可能會減少原本較大的底物4a的空間位阻。

圖6. IR45及其突變體與1a-5a轉化的酶動力學研究。圖片來源：Chem. Sci.

　　接下來，作者研究了N-甲基化步驟。CNMT是(S)-reticulene合成過程中的關鍵酶，作者分析了它對THIQ底物1b-5b的N-甲基化活性。為了改善表達，作者將CNMT基因針對大腸桿菌進行了密碼子優化。而且結果也讓人滿意，CNMT在大腸桿菌中得到了很好的表達。得到的CNMT能夠有效地將所有的S-THIQ底物轉化為相應的N-甲基化產物（轉化率100％）。作者隨后嘗試將亞胺還原酶和N-甲基化酶結合起來，他們用純化的F190L-W191F和F190M-W191F與CNMT和GDH（用于從葡萄糖中回收NADPH），分別合成了THIQAs 2、3和1、4、5。反應結果也讓人滿意，底物轉化率為100%。

　　在這些結果的支持下，作者嘗試在大腸桿菌中構建THIQAs的人工生物合成途徑。為了達到最高的轉化效率，每個步驟都在大腸桿菌系統中進行了單獨評估，然后進行條件優化。首先作者在單個細胞中共表達了三種酶IRED、NMT、GDH，構建了微生物中合成THIQAs的最小生物合成途徑。在最佳條件下，1a、4a和5a（50 mg L-1）可以在一到三天內完全轉化為相應的生物堿（圖7和圖8）；通過乙酸乙酯萃取，可以分別以95％、98％和95％的產率獲得純生物堿1、4和5。為了克服細胞膜通透性的障礙并進一步提高2a和3a的轉化率，作者將酶促轉化和全細胞生物轉化結合到一個反應中。F190L-W191F和GDH這兩種酶首先過表達，并通過超聲裂解得到粗酶液，隨后直接加入到表達CNMT的大腸桿菌的培養液中，這種酶促轉化和全細胞生物轉化的結合可以將2a和3a（50 mg L-1）完全轉化為相應的THIQAs（圖7和圖8），2和3的分離產率分別為93％和96％。這些結果表明，通過系統性地提高酶活性并優化生物催化條件，作者發展的基于IRED的人工生物合成途徑可成功地用于兩種類型植物THIQAs的合成。

圖7.前體1a-5a通過IRED的方法生物合成1-5。圖片來源：Chem. Sci.

圖8. 基于IRED生物合成THIQAs 1-5。圖片來源：Chem. Sci.

　　總結

　　瞿旭東教授課題組使用一種基于IRED的生物催化策略，成功地生物合成5種在藥學上有價值的PIAs和BIAs。值得注意的是，這3種PIA的天然生物合成途徑目前尚未研究清楚。通過酶工程，作者顯著拓寬了IRED IR45的底物特異性，兩個突變體F190L-W191F和F190M-W191F可以有效地將大位阻1-芳基-6,7-二甲氧基-DHIQ底物轉化為(S)-THIQs，CNMT也能夠實現大位阻底物的轉化，再將(S)-THIQs轉化為(S)-THIQAs。這種基于IRED的生物合成法可高效（100％收率）制備多種植物THIQAs，通過添加其他酶（如P450），還有望進一步擴展到其他復雜THIQAs的生物合成中。