團隊開發出枯草芽孢桿菌高效蛋白表達與途徑調控系統

　　枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為革蘭氏陽性菌的模式菌種，具有分泌表達、異源表達水平高和生物安全等優良特性，廣泛應用于淀粉酶、蛋白酶等多種工業蛋白質的表達和維生素、核苷等重要化學品的生產中。目前，商業化枯草芽孢桿菌表達系統匱乏，且表達強度與大腸桿菌T7表達系統和畢赤酵母細胞甲醇誘導表達系統差距較大，且存在誘導物毒性、誘導物價格昂貴等問題，限制了枯草芽孢桿菌在工業化生產中的應用潛力。

　　中國科學院天津工業生物技術研究所研究員張大偉團隊在枯草芽孢桿菌中開發出具有自主知識產權的基于麥芽糖轉錄激活因子操作子（MalO）的基因表達調控系統MATE（maltose-inducible expression system），實現了目標基因的高強度、高嚴謹表達與調控。

　　枯草芽孢桿菌高效蛋白表達調控系統的構建策略及其在途徑調控、合成生物技術應用研究如下：對麥芽糖啟動子PmalA的操作子序列（MalO）進行鑒定、突變和高通量篩選，獲得了一系列具有不同強度的啟動子突變體，并對MalO序列在啟動子中的位置和序列進行調整，構建出在單細胞內能夠兼容的誘導激活型/抑制型系統MATE-ON/OFF，并運用流式細胞儀證明MATE誘導系統具有高均一性和高重復性；對啟動子cre元件和宿主細胞的工程改造，解除了葡萄糖對系統的CCR抑制效應，實現了20g/L葡萄糖條件下維持原本誘導表達強度；加入激活型核糖開關整合轉錄-翻譯調控元件，進一步提高系統嚴謹性，在保持表達強度的條件下實現790倍的誘導倍數，實現了系統強度和系統嚴謹性的兼得；分析了MalO在不同數量和距離下對啟動子強度的影響，通過改變MalO在啟動子中的數量或位置可實現對啟動子強度的減弱或增強，提出了獲得不同梯度強度啟動子元件的新策略，同時，證實了MalO作為轉錄增強子對其他內源啟動子的誘導激活作用，并以α-淀粉酶和hFGF21為例驗證了MalO增強子在激活分子伴侶、促進目標蛋白質表達上的應用；利用MATE系統實現了hFGF21、幾丁質酶、阿洛酮糖異構酶、低聚半乳糖苷酶、甘露聚糖酶等9個異源蛋白質的高效分泌表達，胞內蛋白平均表達水平近60%，胞外蛋白平均表達水平近80%；采用合成生物學策略，構建MATE-on/off開關系統，調控細胞分裂和細胞形態，可高效調控合成途徑實現高產紫桿菌素等營養化學品，同時，證實了MATE作為基因開關和途徑調控工具在基因功能研究及合成生物學中的應用能力，為枯草芽孢桿菌提供了新的高效蛋白表達系統和代謝途徑調控工具。

　　相關研究成果發表在PNAS上。研究工作得到國家重點研發計劃、國家自然科學基金、天津市合成生物技術創新能力提升行動項目的支持。

枯草芽孢桿菌高效MATE表達調控系統的構建和應用