固相化pH梯度雙向凝膠電泳實驗2

在生物醫學研究中，培養的哺乳動物細胞是被廣泛使用的材料。本方案中介紹的方法已經成功用于許多人類克隆的癌細胞系和纖維原細胞系（Ji,etal，1994,1997)。雖然多數細胞蛋白質能用此方法提取，但是一些 DNA 結合蛋白可能會丟失。

如果研究 DNA 結合蛋白，應該使用核酸酶，此方法在方案 3 中詳述。表達蛋白質組學的研究經常需要檢測低豐度蛋白質，一種檢測微量蛋白質的更可靠、更敏感的方法是對細胞蛋白質進行代謝物放射性標記，此方法的詳細介紹見附加方案：用放射性同位素標記真核生物細胞蛋白質。具體步驟詳見本方案的最后。

培養細胞（貼壁或懸浮)

抽提緩沖液IPG緩沖液磷酸鹽緩沖液

細胞刮刀離心機（低溫、低速）濾紙冰浴裝置超速離心機（低溫）旋渦混合器

1.從培養皿中轉移細胞。.

如果是貼壁細胞，用細胞刮刀從培養皿中刮下細胞，用 5 ml 吸管將細胞和培養基轉移到 15 ml 離心管中。

如果是懸浮細胞，直接將細胞和培養基轉移到離心管中。

2.480 g、4°C，離心沉淀細胞 5 min。

3.棄去上清，勿攪動沉淀。

要點：操作以下步驟時，所有細胞需保持冰凍狀態；不離心或振蕩時，保持細胞在冰上。

4.在離心管中加 IOml 冰凍 PBS 洗滌細胞，來回吹打重懸細胞。

5.480 g、4°C，再次離心細胞 5 min。

6.棄去上清，勿攪動沉淀。

7.重復步驟4~6兩次。

8.在最后一次洗滌后，把離心管完全空干，用濾紙將沉淀上殘留的 PBS 吸干。

9.用吸管將抽提緩沖液加到離心管中。

依賴所研究的細胞系來確定抽提緩沖液的體積。細胞裂解液的蛋白質濃度應為 10 mg/ml，不應超過 20 mg/ml。

10.旋渦混合器振蕩離心管 10~30s，重新懸浮沉淀。

11.每 1Oml 抽提緩沖液中加 50ul IPG 緩沖液，IPG 緩沖液終濃度為 0.5%。

12.將細胞裂解液轉移到一個合適的超速離心管中。

13.100000g 離心 20 min。

14.收集上清，小心避免試管底部的清澈黏性的液滴（DNA 和 RNA) 混入上清。

15.用 BCA 方法測定蛋白質濃度（見附錄 2)。

注意：如果用 BCA 檢測，要從抽提緩沖液中去除 DTT, 因為 DTT 會干擾分析。樣品分析完之后，在樣品中加 DTT 至終濃度為 50 mmol/L。

16.將上清分成幾等份，每份 lOOjtxl 或 200 沁。

每一等份的大小取決于待測樣品的量。如果不立即用于 IEF，將樣品儲存在一 80°C。

17.按方案 5 進行第一向 IEF。