圓二色譜分析動態超高壓微射流均質對卵清蛋白二級結構的影晌
圓二色光譜(簡稱CD)是目前應用最為廣泛的測定蛋白質二級結構的方法，是研究稀溶液中蛋白質構象的一種快速、簡單、較準確的方法。它可以在溶液狀態下測定，較接近其生理狀態。而且測定方法快速簡便，對構象變化靈敏，所以它是目前研究蛋白質二級結構的主要手段之一，并已廣泛應用于蛋白質的構象研究中186]。蛋白質是由氨基酸通過膚鍵連接而成的具有特定結構的生物大分子。在蛋白質中，氨基酸的a一碳原子是不對稱碳原子，具有光學活性，蛋白質的膚鏈走向也是不對稱的結構，也具有光學活性，當平面圓偏振光通過這些光活性的生色基團時，光活性中心對平面圓偏振光中的左、右圓偏振光的吸收不相同，產生了吸收差值，由于這種吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圓偏振光變成了橢圓偏振光，這就是蛋白質的圓二色性。通過測定蛋白質溶液的圓二色性，可以研究蛋白質的二級結構及其變化信息[87一l。一般蛋白質的圓二色光譜分為兩段，波長范圍在185一245Inn稱為遠紫外區，245一320nln稱近紫外區。具有不同二級結構的蛋白質或多膚所產生的CD譜帶的位置、吸收的強弱都不相同。a一螺旋結構在靠近192Inn有一正的譜帶，在222和208nm處表現出兩個負的特征肩峰譜帶;p一折疊的CD譜在216nm有一負譜帶，在185一Zoonln有一正譜帶;p一轉角在206lun附近有一正CD譜帶。遠紫外區是蛋白質膚鏈的吸收峰，反映了主鏈的構象。因此，可利用這一區域的CD光譜推算蛋白質分子中的a一螺旋、p一折疊、p一轉角以及無規卷曲的含量191]。本實驗利用圓二色光譜分析經動態超高壓微射流均質處理后的卵清蛋白的二級結構變化情況。下圖分別為經不同均質壓力處理后的卵清蛋白的圓二色譜圖。
圖4.24一圖4.28分別為不同壓力處理的卵清蛋白與對照組的CD譜。可以看出，不同壓力對卵清蛋白CD譜的影響程度不同。與未處理的樣品相比，經不同壓力處理后卵清蛋白CD譜曲線，譜峰峰位和峰高均發生了不同程度的變化。由圖4.22中可知，未處理的卵清蛋白樣品的CD譜在208nm和222nm附近處有兩個寬負峰譜帶;在190一202lun有一正譜帶。從各譜峰位及峰形來看，說明卵清蛋白以多種構象共存，并以a一螺旋結構為主。經不同壓力處理后，在192run出現明顯的正峰譜帶，并且在192tun和222nm處峰強有所提高，而在190nm處，峰強減小，這說明經高壓均質處理后卵清蛋白的a一螺旋的含量有所增加(這與紅外光譜的結果相一致)，p一折疊有所減少。將CD圖譜與、認ng氏參照CD光譜擬合后估算出卵清蛋白二級結構中a一螺旋，p一折疊，p一轉角和無規卷曲所占的比率。.圓二色譜的結果表明，動態超高壓微射流均質使卵清蛋白的二級結構發生了變化。a一螺旋含量增加，既a一螺旋結構有所展開，并發生去折疊現象。且過高的壓力使卵清蛋白的a一螺旋和p一轉角又向p一折疊轉化。
(10)圓二色譜分析
用JASCOJ一810旋光儀舊本JASCO公司)測定卵清蛋白的遠紫外圓二色譜變化170]。旋光儀與電腦連接以Jasco軟件操作。將經過處理后卵清蛋白溶液注入0.Icm厚的橢圓形比色皿中，在25℃和連續充氮的條件下，進行遠紫外區域190一250nm)掃描，速度為50nln/min，光譜間隔0.Inln，3次累積。由儀器提供的、認ng氏參照CD光譜估算卵清蛋白二級結構中a螺旋，p折疊，p轉角和無規卷曲所占的比率。