培養細胞中RNA檢測－NorthernBlot

培養細胞中RNA檢測－Northern Blot

1．制膠：（1％）

瓊脂糖                2.5g

10×Mops緩沖液   25.0ml

H₂O               192.0ml

2．在微波爐中加熱煮沸使膠完全溶于水并滅菌。

3．取出膠冷卻到60℃，于通風柜中加45ml甲醛，混勻。

4．加20μl溴化乙錠，混勻。

5．令膠液再冷卻10分鐘。

6．將其倒入四面封好的電泳槽中，加樣品梳，約20分鐘形成電泳凝膠。

7．加入1×Mops緩沖液于電泳槽，蓋滿膠表面，但不>25px。

8．取10～15μg RNA樣品，真空離心干燥，再溶于20μl載樣緩沖液，加熱95℃ 2分鐘，使RNA變性。

9．每孔中20μl RNA點樣，同時加一標準物。

10．  一般35V電泳，從下午4pm～9：30am。

11．  取出膠在紫外燈下觀察，將刻度尺放在膠旁照像。成功的電泳在膠上28S（約5kb）18s（約2kb）處可見明顯的溴化乙錠帶。

12．  用500ml 10×SSC浸泡洗滌膠2次，每次20分鐘，去除甲醛。

13．  其它吸印步驟完全與Southern Blot相同，只是吸印緩沖液為10×SSC。

14．  室溫下至少吸印12小時。

15．  吸印完成后，取出膠與濾膜，表明加樣起始部位、膜的方向及標號、用Whatman濾紙包好，80℃真空干燥2小時；如為尼龍膜在紫外燈下照射5分鐘。

16．  分子雜交：雜交原理與Southern Blot相同，但所用雜交液及雜交、洗滌溫度與之不同。預雜交液制備：

50％ 甲酰胺

1％ SDS

1M NaCl

10％ 硫酸葡聚糖

17．  將濾膜放入塑料袋，加入10ml預雜交液，去除氣泡后封袋，在42℃水浴中振蕩至少6小時。

18．  制備變性魚精DNA≥100μg/ml，變性同位素標記的探針（加入袋中的終濃度≤10ng/ml或1～4×10⁵dpm/ml）。

19．  將此液0.5～1ml以針頭注入含預雜交液的塑料袋中，排除氣泡，從針眼處重新封死塑料袋，再用玻棒在袋上趕幾次，使探針與預雜交液充分混勻，42℃振蕩水浴6～42小時。

20．  膜的洗滌：

a.       2×SSC 100ml室溫中振蕩5分鐘，共2次。

b.      1％SDS的2×SSC 200ml 60℃振蕩30分鐘，共2次。

c.       0.1×SSC 100ml室溫振蕩30分鐘，共2次。

21. 膜在室溫中自然干燥后，用塑料紙包好即可進行放射自顯影過程（同DNA檢測）。