蛋白質的Westernblot印跡分析

一、原理

　　一個基因表達的最終產物是產生相應的蛋白，因此檢測蛋白是測定基因表達的主要標志。 

   原理：Western Blotting 是將獲得的蛋白質樣品通過SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳，對不同分子量的蛋白質進行分離；并通過轉移電泳將凝膠上分離到的蛋白質轉印至固相支持物上，用抗靶蛋白的非標記抗體（一抗）與轉印后膜進行雜交，使其與膜上的靶蛋白特異性結合；再與經過氧化物酶標記的二抗結合，最后用ECL試劑反應，經X線片曝光、顯影等一系列反應，檢測蛋白質等生物大分子。

二、方法

　　樣品蛋白的制備

　　SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳 轉膜 檢測

三、樣品蛋白的制備

　　1、原理：

　　蛋白質的制備工作涉及物理、化學和生物等各方面知識，但基本原理只有兩個方面：

　　一是用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析、有機溶劑提取、 層析和結晶等；

　　二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使備組分分配于不同區域而達到分離目的，如電泳、超速離心、超濾等。

　　2、蛋白質制備的步驟 

（1） 選擇材料和預處理 

（2）細胞的破碎及細胞的分離 

（3）提取和純化 

（4）濃縮、干燥和保存

　　3、培養細胞中蛋白質樣品的提取

　　提取細胞蛋白多是利用將細胞裂解、破碎、使蛋白質釋放 的原理，在提取蛋白質的實驗中要考慮到細胞裂解液的pH、去 污劑的類型和濃度，以及二價陽離子、輔助因子等因素，同時 為防止細胞內蛋白酶對蛋白質的降解，需在裂解液中加入蛋白 酶抑制劑。

　　3.1 實驗材料

　　（1）器材： 冷凍離心機， 細胞刮，Tip頭、1.5ml、 0.5ml 滅菌Ep管，碎冰。

　　（2）試劑：

　　① 細胞總蛋白裂解液（100ml）: 1×PBS 80ml，Triton100 1ml, 去氧膽酸鈉0.5g, SDS 0.1g, 補 1×PBS緩沖液至 100ml。 ② PMSF貯存液（PMSF 17.4mg/異丙醇）： PMSF（苯 甲基磺酰氟）在水溶液中不穩定，應在臨用前向不含PMSF的裂 解緩沖液中加入PMSF貯存液100ul,使其終濃度為0.174mg/ml。 （3）Hela 細胞

　　3.2 實驗方法 

（1） 洗滌細胞：選取細胞培養皿中培養的Hela細胞，由37℃ 取出后放入冰盤中，預冷。吸棄原培養液，用4 ℃預冷的 1×PBS洗細胞表面3～4次，除凈培養基中的血清，并盡量吸棄 細胞培養皿中殘余的PBS。 

（2） 向培養皿中加入蛋白裂解液(100ul/60mm)，輕輕晃動， 使裂解液均勻鋪于細胞表面。 

（3） 冰浴30～60min，期間晃動3～4次。

（4） 用細胞刮子集中裂解液，收集入冰上預冷的1.5ml Ep 管 中， 4 ℃離心，12000g 20min.

（5） 小心吸取上清液入新的預冷管中（為避免反復凍融導致 蛋白降解，可按需要將其分裝使用），-80 ℃保有存備用（可 保存1年）

　　3.3 注意事項

（1） 注意個人防護：PMSF嚴重損害呼吸道黏膜、眼睛及皮 膚，吸入、吞進或通過皮膚吸收有致命危險。一旦眼晴或皮 膚接觸了PMSF，立即用大量清水沖洗。

（2） 設立必要實驗對照。 

（3） 為防止蛋白降解，上述操作全部應在冰上完成。 

（4） 所用離心機需要提前預冷。

（5）可于顯微鏡下觀察細胸裂解的程度。

（6）吸取蛋白上清液時，注意不要把沉淀吸上來。

　　4、蛋白質的濃度測定——考馬斯亮藍蛋白定量法

　　考馬斯亮藍 G－250 法是比色法與色素法相結合的復合方 法，簡便快捷，靈敏度高，穩定性好，是一種較好的常用方 法。 4.1 原理

　　考馬斯亮藍 G-250 在游離狀態下呈紅色，最大光吸收在 488nm；當它與蛋白質結合后變為青色， 蛋白質-色素結合物 在 595nm 波長下有最大光吸收。 其光吸收值與蛋白質含量 成正比， 因此可用于蛋白質的定量測定。 蛋白質與考馬斯亮 藍 G-250 結合在 2min 左右的時間內達到平衡，完成反應十 分迅速；其結合物在室溫下 1h 內保持穩定。

　　4.2 實驗材料

　　（1）器材：分光光度計及玻璃比色皿

　　（2）試劑：

 ①0.5% mg/ml BSA 標準蛋白液：生理鹽水配制，分裝小管， 4℃保存。

 ②考馬斯亮藍 G-250 母液：稱取考馬斯亮藍 G-250 100mg 溶 于 50 ml 95%乙醇，加入 100 ml 濃磷酸(W/V)。過濾， 4℃ 保存6個月。

 ③考馬斯亮藍 G-250 使用液（0.01%考馬斯亮藍 G-250 ）： 取考馬斯亮藍G-250 母液 15 ml，加蒸餾水稀釋至 85 ml，臨 用前稀釋。

　　4.3 實驗方法

（1） 稀釋BSA標準品及制作標準曲線：用生理鹽水將 0.5mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）標準蛋白液稀釋成 0,1,2,4,8,10,12 ug/100ul

（2）上述每管中分別加入 1.5ml 考馬斯亮藍 G-250 使用液， 室溫反應后測定 595 nm吸光度值(OD595)，依據所得數據制作 標準曲線。 

（3）稀釋待測蛋白樣品：吸取細胞總蛋白樣品 2 ul，加入 98 ul 水（總體積為 100 ul ）和 1.5 ml 考馬斯亮藍使用液，混勻 后室溫反應3～5 min，測定OD595 。 

（4）計算樣品總蛋白含量(ug/ul)：根據標準曲線圖，找出樣品蛋白在圖中的位置，并計算出蛋白含量。

　　4.4 注意事項 

（1）制作的BSA標準曲線如不規律，應重新再做。 

（2）如果待測樣品濃度高（如組織提取物），可用生理鹽水 稀釋倍后測定；如樣品濃度底，可適當增加樣品體積及減少水 的體積。 

（3）比色皿的清潔：由于測定液中含有考馬斯亮藍，使用過 的比色皿呈藍色并藍色不易被清水沖洗掉，需用無水乙醇先將 比色皿脫色皿脫色數分鐘，而后分別用自來水、蒸餾水沖洗干凈。

　　四、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈

　　1、原理 

各種蛋白質因所帶的凈電荷、分子量大小和形狀不同面有不同 的遷移率。如果在電泳體系加入SDS，形成帶負電荷長橢圓棒狀 的蛋白質-SDS復合物。從而消除蛋白質原有的電荷和形體差異， 從而對蛋白質進行分離。 當對蛋白質樣品做SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈分析時，要在樣 品中加入含有SDS和B-巰基乙醇的樣品處理液。

　　樣品處理液中加入溴酚藍染料，用于控制電泳的過程。

　　另外在樣品液中加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時，使樣品溶液可以沉入樣品凹槽底部。

　　SDS-聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取決于用于灌膠的聚丙烯酰 胺的濃度和交聯度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠大多按雙丙烯酰胺：丙烯酰胺為了1：29配制，實驗表明它能分離大小相差只有3%的多肽。 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈成功的關鍵之一是電泳過程中蛋白質 與SDS的結合程度。影響它們結合的因素主要有三個：

　　（1） 溶液中SDS單體的濃度 SDS在水溶液中是以單體和SDS-多 肽膠束的混合形式存，能與蛋白質分子結合的是單體。單體的濃度 與SDS總濃度、溫度和離子強度有關。

　　（2） 樣品緩沖液的離子強度 SDS-PAGE的樣品緩沖液離子強度較 低，常為10～100mmol/L

　　（3） 二硫鍵是否完全被還原 只有二硫鍵被徹底還原后，蛋白質 分子才能被解聚，SDS才能定量地結合到亞基上，使蛋白質的相對遷移率和分子量的對數呈線性關系。

　　2、實驗 

2.1 實驗材料 

（1） 器材： 垂直電泳槽，穩壓穩流電泳儀/電轉儀，蛋 白變性用加熱儀器，Tip頭，Ep管，碎冰，注射器等。

（2）1.0mol/L Tip· (PH 6.8) HCl

（3）1.5mol/L Tip· (PH 8.8) HCl 

（4）10%SDS室溫保存：去離子水配制。 

（5）10%過硫酸銨（保存）：提供驅動丙酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。由于過硫酸銨會緩慢分解， 應隔周新鮮配制。

（6）TEMED（N，N，N，N’-四甲基乙二胺）：催化過硫酸 胺形成自由基而加速丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合。 （7）5 ×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（1000ml）：去離子水 500ml，Tris 堿15.1g，甘氨酸94g, 10%(W/V)電泳級SDS 50ml，補去離子水至1000ml。使用前做5×稀釋 （8）4×蛋白質電泳上樣緩沖液 （9）蛋白質預染Marker

2.1 實驗方法 

1、制備SDS-PAGE凝膠 

（1）準備SDS-PAGE凝膠電泳用玻璃板夾板 

（2）配制10% SDS-PAGE分離膠（15ml） 

（3） 灌制分離膠 

（4）立即用0.1%SDS液覆蓋膠面（隔絕空氣有助于凝膠 聚合，使凝膠面形成平直），室溫放置約40min至分離膠凝固。 

（5）配制5%濃縮膠4ml (可以與配制分離膠時同時進行)

（6）倒掉（吸附）0.1%SDS覆蓋液，用去離子水沖洗分離 膠表面3～4次，以洗凈未聚合的丙烯酰胺（避免在膠頂部 或玻璃夾板中留有氣泡），并用吸水紙吸掉殘留的液體。 

（7） 將凝膠板重新垂直放置，輕輕加入5%積層膠液（注 意避免產生汽泡），插入樣品梳，使液面至樣品梳上標志位置，室溫凝膠約40min. 

（8）輕輕拔去梳子，撕去封玻璃夾板用透明帶，將玻璃夾 板“凹”面緊貼緊電泳槽，兩側用夾子很好地固定在電泳槽上。用針頭式注射注射器吸取電泳緩沖液輕輕沖洗點樣孔，以去除未聚合的凝膠，待上電泳。

2、樣品變性及電泳

（1）由 -80℃冰箱取出Hela細胞總蛋白樣品，立即插入冰中（減少 蛋白降解）待其融化。 

（2）吸取細胞總蛋白樣品15 ul 加入0.5 ul EP管中，每樣品管中分 別加入5ul 4×蛋白質凝膠電泳上樣緩沖液，輕輕混合，98℃變性 8min（同時變性標準分子量Marker），立即插入冰中，渦旋數秒， 短暫離心。 

（3）吸出變性蛋白液，貼緊加樣孔上方，將樣品輕輕加入凝膠孔 中。 

（4）將電泳儀設置成穩壓狀態，接通電源，將電壓調至100V使樣 品通過濃縮膠（電壓約8V/cm）。當染料進入分離膠后，將電壓調 高到130V（約15V/cm）,繼續電泳使染料至分離膠適當位置（4℃ 冰箱中進行電泳），結束電泳。

　　注意事項：

（1）設立必要的蛋白質分子量標志物。

（2）丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強的神經毒性并容易吸附于 皮膚，其作用具有累積性，故稱量時應帶手套及口罩。 

（3）不同廠家的SDS可引起多肽的遷移圖譜變化較大，建議認 準使用某一試劑級別。 

（4）一旦加入TEMED，應立即混旋并快速灌注入玻璃夾板。 

（5）過硫酸銨會緩慢分解，應隔周新鮮配制。 

（6）為保持電泳的平衡，在無樣品孔中也應加入適量的4×蛋 白質電泳液。

（7）正確連接電泳連線正、負極方向（負極在上，正 極在下），經保證電荷由負極向正極流動。 

（8）凝膠玻璃板要定期做硅化處理：用氯仿或庚烷配 成5%二氯二甲硅烷溶液，用其浸泡或擦拭玻璃板，有機溶劑揮發時，二氯二甲硅烷即沉積在玻璃制品上。使用前用水反復沖洗多次或于180℃烘烤2h。

五、轉膜

　　凝膠電泳結束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉移電 泳方式轉印至固相支持物上，然后分別用非標記一抗及二級 免疫試劑對其進行孵育、檢測。

　　用于印跡法的固相支持物有多種，硝酸纖維素膜、尼龍膜 及PVDF膜較為常用。下面是介紹PVDF（聚偏氟乙烯）膜作為 固相支持物。 轉膜的方式有濕轉和半干轉，下面介紹的濕轉方法。

　　1、實驗材料

　　（1）器材： 轉移電泳儀，轉儀電泳槽，PVDF膜，剪刀，濾 紙等。

　　（2）試劑：

　　①轉移緩沖液：Tris 3.03 g，甘氨酸 14.4 g，甲醇 200 ml， 補ddH2O至 1000ml，每次配完可用2～3次。最好現配現用。 4℃ 避光保存。 ②考馬斯亮藍染色液（100ml）：考馬斯亮藍 R-250 0.25 g， 甲醇 50ml ，乙酸 10ml，蒸留水 40ml。待考馬斯亮藍R-250 溶解，用Whatman 1號濾紙過濾，以去除顆粒狀物質。 ③脫色液：乙酸 10% (V/V)，甲醇 50% (V/V)，H2O 40% 。

2、實驗方法 

（1）PDVF 膜及濾紙的預處理：剪裁與膠大小一致的 PVDF膜，將其浸入甲醇液中浸泡10 s（快速激活PDVF 膜），去離子水處理5min，1×轉移緩沖液處理10min 以上。 

（2）剪裁與膠同樣大小的6層濾紙，用轉移液緩沖液浸 泡后待用。

（3）取下電泳板，將其平置（使凹面玻璃板在下）， 小心取出夾板中的墊片及去掉上層玻璃板，切除多余凝膠，將含樣品膠在蒸餾水及1轉膜液中各漂洗一次。

（4）轉膜： ①將樣品膠與膜裝入標有正、負極的轉膜夾板中：由正 極側開始，依次為海綿墊片→3層濾紙→PVDF膜→樣品膠 →三層濾紙（排除氣泡）→海棉墊片，扣緊轉膜夾板， 放入含有轉膜緩沖液的轉移電泳槽中。 ②正確連接轉移電泳連線，使電荷由負極向正極流動。 接通電源，恒壓狀態下，80V 轉膜2 h（此操作在4℃冰 箱中進行） ③小心取出轉移膜（用鉛筆輕輕描出蛋白Marker帶）， 在1×TBST液中漂洗兩次。 ④將凝膠浸入考馬斯亮藍染色液中，檢查蛋白轉移是否 完全。

注意事項：

（1）開始轉移時一定要檢查電流大小。過高電流產生的熱量 會導致轉移失敗，通常高電流是由于轉移液配制不當造成的。

（2）低離子強度轉移緩沖液可使用較高電壓，而不會導致高 電流和過熱，但轉移過程中由凝膠中滲出的電解質可導致轉移 緩沖液電導增加，緩沖能力降低。

（3）也可在恒流狀態下以200mA轉移2h。 

（4）若轉移中因凝膠變形發生條帶扭曲或由于凝膠中電解質 滲出導致過熱，可預先將凝膠在轉移緩沖液中浸泡。

（5）使用預先染色的蛋白質分子量標準品或轉移后將凝膠 染色，可檢查轉移是否徹底。 

（6）對于較大蛋白質，較低的丙烯酰胺濃度可獲得較好的 轉移效果。 

（7）對電轉移來說，最常遇到的問題是目的蛋白質轉移效 率低，轉移效率可由轉移后對凝膠或膜染色來進行觀察。

六、檢測

1、實驗器材 

（1）器材：搖床，避光盒，洗膜用平皿，X線片，X線片曝 光盒等。 

（2）試劑：

① 10×TBST緩沖液：100 mmol/L Tris· (pH 8.0)， HCl 1500mmol/L NaCl，0.2% Tween-20，補水至1000ml，高 壓滅菌，4℃保存，使用前稀釋10倍。

② 5%脫脂奶粉（1×TBST配制）。

③ 一抗：羊抗Actin (使用前用1×TBST稀釋200倍)。

④二抗：兔抗羊Ig G/HRP (使用前用1×TBST稀釋2000倍)。 

⑤ECL試劑盒。

2、實驗方法 

（1）封閉：將轉移后的膜放入5%（W/V）脫脂奶粉中，室溫、 搖床上緩慢搖動狀態下封閉1h(或4℃過夜) 

（2）一抗反應：①將一抗（羊抗Actin） 用1×TBST稀釋200 倍)；②將封閉后的膜直接放入上述抗體中， 4℃反應過夜。 

（3）洗膜：將反應膜放入平皿中，用1×TBST漂洗一次，繼 而用1×TBST洗滌3次（室溫下緩慢搖動洗滌）以洗凈未結合 的一抗，每次換入新液洗滌10min。 

（4）二抗反應：①將二抗（兔抗羊 Ig G/HRP ）用1×TBST 稀釋2000倍；②將經一抗作用過的膜放入上述二抗液體中 （室溫、避光緩慢搖動）作用50min(不超過60min). 

（5）洗膜：用1×TBST洗膜，方法同（3），洗去二抗。

（6）曝光及洗片： ①按1:1（V/V）混合ECL試劑盒中兩種液體，在辣根過氧化物 酶（HRP）催化下，過氧化物酶與 Luminol 增劑反應發強光， 可見信號可以用壓片法檢測。Western 實驗中，HRP標記在二 抗上，與一抗靶蛋白復合物結合，再用底物進行發光檢測。 ②將上述混合液均勻鋪在PVDF膜表面，室溫作用2min，抖掉 膜上液體，將膜用保鮮膜包裹（避免在膜的上面出現氣泡） ③在暗室中（紅光下），將X線膠片直接壓于包裹后的膜上， 曝光適當時間。 ④將曝光后X光線片在清水盤中浸濕→顯影液中顯影→清水中 漂洗→定影液中定影 5 min（具體曝光時間及顯影時間需根據 顯影結果作出調整）。

注意事項：

（1）選擇合適的一抗及二抗濃度。 

（2）選擇合適的封閉液。

（3）吸取ECL試劑時要注意更換Tip尖。兩種試劑一經混合， 應在內使用。

（4）注意避光操作。 

（5）應考濾ECL試劑的發光強度極其衰滅時間，因此請按說 明書及實驗具體情況進行。