培養細胞標記和裂解物的制備實驗

實驗材料 培養細胞

試劑、試劑盒 DMEMHClTBSTris

儀器、耗材 微量離心管Plexiglas盒吸頭細胞刮子冷凍離心機

實驗步驟

1.  培養待標記的細胞至適當的生長期。
 
對于貼壁細胞：
 
2a.  吸去培養液，用37℃的含血清不加標記物的標記培養液洗盡殘存的含磷酸鹽培養液，吸盡該培養液。
 
3a.  加入預熱的標記培養液，加入量為：0.5~1 ml/35 mm 培養皿，1~2 ml/50 mm 培養皿，或2~4ml/ 100 mm 培養皿。
 
對于非貼壁細胞：
 
2b.  1 800 g 離心1 min，吸去培養上清，細胞用含血清不加標記物的標記培養液重懸， 再次離心吸去堉養液。
 
3b.  每107細胞加入2 ml 標記培養基至適合大小的培養平皿。
 
4.  在Plexiglas 擋板后操作，使用配備塞有棉花分防氣溶膠的傲量移液器加入32Pi至終濃度為0.1~2 mCi/ml。
 
5.  將培養皿置于預熱的Plexiglas 盒中，并將金子置于培養箱中。
 
6.  標記結束時，將裝有標記細胞的Plexiglas 盒移至冷室，放在Plexiglas 擋板后面。
 
對于貼壁細胞：

7a.  從Plexiglas 盒子中取出培養皿，用一次性的移液管吸盡標記培養液，培養液和吸頭或吸管均作為同位素廢物棄置。
 
8a.  用2~10 ml 冷TBS洗滌細胞2次，同步驟7吸盡并棄去放射性廢物。
 
9a.  加適量裂解緩沖液，用橡皮細胞刮子擦刮下貼壁細胞，裂解物留在培養皿上，4℃放置20 min。用橡皮細胞刮子將貼壁細胞的裂解液移至培養皿邊緣，并將裂解液移入帶螺口蓋的微量離心管中。
 
對于非貼壁細胞：

7b.  從Plexiglas 盒子中取出培養皿，將細胞移至帶螺口蓋的微量離心管中，1 800 g 離心1 min，回收細抱，吸盡培養液。

8b.  細胞用小體積的冷TBS重懸，移至帶螺口蓋微量離心管中，1 800 g 離心1 min，吸盡TBS。
 
9b.  毎107細胞用0.5~1 ml 適當的裂解緩沖液懸浮細胞，用一次性的巴斯德吸管輕輕混勻，4℃放置20 min。

10.  蓋上管蓋，于4℃ 26 000 g 離心30 min 澄清裂解液。
 
11.  離心后，將上清（裂解物）移至新的離心管中，離心管和沉淀作為同位素污物處理。

12.  用凝膠電泳，免疫沉淀或蛋白質純化方法，分析標記的裂解液，所有過程均在4℃適當屏蔽下進行。