篩選是酶定向進化的瓶頸。酶理性設計及計算機虛擬篩選技術可有效解決這一瓶頸，是定向進化領域的重要發展方向。近年來基于構象動力學指導的酶理性設計取得一系列成功，該策略的關鍵是精準定位殘基位點，通過引入合適突變，增強催化口袋的構象變化，進而改造底物譜、對映體選擇性及熱穩定性等催化特性。
中科院天津工業生物技術研究所孫周通研究員帶領的酶分子工程與工業生物催化研究團隊圍繞這一熱點領域，以嗜熱醇脫氫酶TbSADH及其非天然前手性酮底物為研究對象。基于TbSADH晶體結構，分別在30°C和60°C下對該酶進行分子動力學（MD）模擬，結果表明催化口袋內的A85、I86、L294及C295位點的運動自由度較差（圖1a）。經虛擬突變分析，鎖定85及86位點為重點改造對象。采用CAST策略構建小而精的突變體文庫，僅篩選100多個突變體，即獲得高效突變體，實現酶催化活力（98% conv.）與立體選擇性（99% ee）雙參數同時改造。此外，經MD模擬分析，發現最優突變體（A85G/I86L）改造后位點所在loop區域柔性（圖1b）明顯強于野生型（圖1c），且催化口袋體積增大，證明在85和86位點引入突變可有效重塑酶催化口袋。綜上，本研究通過在TbSADH活性位點loop區域引入合適突變，可有效重塑酶催化口袋，賦予其不對稱催化還原非天然前手性酮底物的能力；同時為將來類似的酶改造工作提供理論指導。
上述研究得到國家自然科學基金等項目資助，相關結果已在線發表于國際期刊Advanced Synthesis & Catalysis。
圖1. (a) 催化口袋各位點運動性分析；(b)最優突變體及(c)野生型改造位點所在loop區域柔性