實驗方法原理
體外測定免疫細胞的數量和功能常需將某種免疫細胞首先分離出來。本實驗是采用密度梯度離心法分離單個核細胞(mononuclear cell)。單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞(monocyte)。 血液中各種細胞的大小和比重不同,因此,可用不同比重(密度)的分離液使不同比重的細胞在離心沉降過程中按相應密度梯度分布,從而達到分離各種細胞的目的,入單個核細胞的比重為 1.075~1.090,而紅細胞、粒細胞等的比重在 1.092 左右,因此,將血液輕輕加在比重為 1.076~1.078 的分離液上,使成一界面,再經離心,即出現分層,最上面為血漿層,界面處有一白色云霧狀細胞層即為淋巴細胞和單核細胞,而紅細胞和粒細胞則沉于管底。分離液的比重受溫度變化的影響,實驗應在室溫(20 ℃)下進行,若實驗時,室內溫度低于 20 ℃ 則先將分離液在 37 ℃ 水浴中高于 20 ℃ 的夏季,得率可能偏低。
實驗材料 人靜脈血(每毫升血用 20 單位肝素抗凝)
試劑、試劑盒 聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-lsopaque)淋巴細胞分離液(比重 1.077±0.001)Hanks 液95% 甲醇水溶液Jenner(May-Grunwald)染液Giemsa 染液95% 乙醇
儀器、耗材 圓底小試管1 ml 或 2 ml 吸管毛細吸管載玻片水平式離心機
實驗步驟
1. 加淋巴細胞分離液 2 ml 于圓底試管中。
用吸管直接伸入試管底加入,以防分離液沾上試管壁。
2. 于另一試管中,加靜脈抗凝血(每毫升血加 20 單位肝素)2ml,再加等量 Hanks 液將血液稀釋。
3. 用毛細吸管將此抗凝稀釋的血液沿管壁徐徐加入分離液試管中,使與分離液形成一界面,兩者不能混合。
4. 離心
室溫(20 ℃)下于水平離心機中,2000 r/min 離心 20min。
5. 取出試管,此時可見試管內已分層,用一毛細吸管插入界面白色細胞層,吸出細胞,移入另一試管內。
6. 加入 1 ml Hanks 液,懸浮細胞。
7. 制片
7.1 取一滴細胞懸液于一干凈載玻片的一端,用另一邊緣光滑的玻片按「吞噬作用」實驗的方法推片。
7.2 干燥、固定 于空氣中自然干燥,然后用 95% 甲酵固定 2 min。
7.3 染色將涂片浸于 0.25% Jenner 染液中 5~10 min,再移到 1:20 Giemsa 染液中 20min,用水沖洗。
7.4 脫色 用 95% 乙醇脫色 30 s,水沖洗。
8. 鏡檢
干燥后,在顯微鏡下觀察單個核細胞的形態。若觀察到細胞著色太藍,可再脫色 30 s。