大腸菌群介紹與檢測方法

一、大腸菌群介紹
　　大腸菌群并非細菌  學分類命名，而是衛生細菌領域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。一般認為該菌群細菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。
　　大腸菌群分布較廣，在溫血動物糞便和自然界廣泛存在。調查研究表明，大腸菌群細菌多存在于溫血動物糞便、人類經常活動的場所以及有糞便污染的地方，人、畜糞便對外界環境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。糞便中多以典型大腸桿菌  為主，而外界環境中則以大腸菌群其他型別較多。
　　大腸菌群是作為糞便污染指標菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內除一般正常細菌外，同時也會有一些腸道致病菌存在（如沙門氏菌、志賀氏菌等），因而食品中有糞便污染，則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險性。
　　大腸菌群是評價食品衛生質量的重要指標之一，目前已被國內外廣泛應用于食品衛生工作中。

二、檢驗方法：
　　由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，即：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進行。
　　目前國內采用的進出口食品大腸菌群檢測方法主要有國家標準和原國家商檢局制訂的行業標準。兩個標準方法在檢測程序上略有不同。
（一）國家標準：國家標準采用三步法，即：乳糖發酵試驗、分離培養和證實試驗。
　　乳糖發酵試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發酵管。36±1℃培養48±2h，觀察是否產氣。
　　分離培養：將產氣發酵管培養物轉種于伊紅美藍瓊脂  平板上，36±1℃培養18-24h，觀察菌落形態。
　　證實試驗：挑取平板上的可疑菌落，進行革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發酵管36±1℃培養24±2h，觀察產氣情況。
　　報告：根據證實為大腸桿菌陽性的管數，查MPN表，報告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。
　　具體操作參見GB4789.3-94 《中華人民共和國國家標準 食品衛生微生物學檢驗 大腸菌群測定》
（二）原國家商檢局制訂的行業標準，等效采用美國FDA的標準方法，用于對出口食品中的大腸桿菌進行檢測。本方法采用兩步法：
　　推測試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉湯。36±1℃培養48±2h，觀察是否產氣。
　　證實試驗：將產氣管培養物接種煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中，36±1℃培養48±2h，觀察是否產氣。以BGLB產氣為陽性。查MPN表，報告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值。
　　具體操作參見 SN0169-92 《中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法》

三、說明：
1．MPN檢索表：
　　MPN 為最大可能數(Most Probable Number)的簡稱。這種方法，對樣品進行連續系列進行稀釋，加入培養基進行培養，從規定的反應呈陽性管數的出現率，用概率論來推算樣品中菌數最近似的數值。
　　MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內數字應相應降低或增加10倍。注意國家標準和行業標準中所附MPN表所用稀釋度是不同的，而且結果報告單位也不相同。
2．初發酵和證實試驗：
　　無論是國家標準的三步法還是行業標準的兩步法，都利用了乳糖發酵管進行了兩次發酵試驗，培養基的配制略有不同，但都是為了證實培養物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產酸產氣”。
　　初發酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細菌，經過證實試驗后，有時可能成為陰性。有數據表明，食品中大腸菌群檢驗步驟的符合率，初發酵與證實試驗相差較大。因此，在實際檢測工作中，證實試驗是必需的。
3．產氣量與倒管：
　　在乳糖發酵試驗工作中，經常可以看到在發酵倒管內極微少的氣泡（有時比小米粒還小），有時可以遇到在初發酵時產酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實驗表明，大腸菌群的產氣量，多者可以使發酵倒管全部充滿氣體，少者可以產生比小米粒還小的氣泡。如果對產酸但未產氣的乳糖發酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應考慮可能有氣體產生，而應作進一步試驗。
4．挑選菌落：
　　國家標準中，需要對初發酵陽性培養物接種伊紅美藍平板分離，對典型和可疑菌落進行觀察和證實試驗。由于大腸菌群是一群細菌的總稱，在平板大腸菌群菌落的色澤、形態等方面較大腸菌更為復雜和多樣，而且與大腸菌群的檢出率密切相關。國家標準方法規定伊紅美藍平板為分離培養基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無光澤時，檢出率最高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低。
　　另外，挑取菌落數與大腸菌群的檢出率有密切關系，只挑取一個菌落，由于機率問題，尤其當菌落不典型時，很難避免假陰性的出現。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無典型菌落則應多挑幾個，以免出現假陰性。
5．抑菌劑：
　　大腸菌群檢驗中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽性菌的生長。
　　國家標準中乳糖膽鹽發酵管利用膽鹽作為抑菌劑，行業標準中LST肉湯利用十二烷基硫酸鈉作為抑菌劑，BGLB肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑。
　　抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群細菌的生長和挑選，但對大腸菌群中的某些菌株有時也產生一些抑制作用。有些抑菌劑用量甚微，稱量時稍有誤差，即可對抑菌作用產生影響，因此抑菌劑的添加應嚴格按照標準方法進行。