這一經典的蛋白相互作用研究方法接近于體內環境，那些瞬時、不穩定的兩兩相互作用也可以被檢測到，并且與內源蛋白的表達無關[6]。鑒于這些優點并結合簡便高效的Gateway表達載體構建方法[7]，在大規模的蛋白質－蛋白質相互作用研究中酵母雙雜交系統得到了最為廣泛的應用。Rain 等[8]用該法繪制了人類胃腸道病原菌Helicobacter pylori 的大規模蛋白質相互作用圖譜。在261 種蛋白中，確立了 1200 種相互作用關系，涵蓋了整個蛋白質組得46. 6%。隨后，Giot 等[9]和Li 等[10]在果蠅和線蟲中也成功地研究了大規模的蛋白質相互作用。除了對模式生物的研究外，Stelzl 等[11]和Raul 等[12]則先后分析了人腦組織、人已知ORF中大規模的蛋白質相互作用網絡。但酵母雙雜交方法本身也有一定的局限性：(1)不能研究具有自激活特性的蛋白質；(2)只能檢測兩個蛋白間的相互作用；(3)檢測的相互作用需發生在細胞核內，對于不能定位到細胞核中的蛋白質無法研究；(4)大部分實驗中有將近50%的假陽性率，且推測的相互作用僅有3% 在兩種以上的實驗中得到驗證。為了彌補方法本身的缺點及局限性，研究者也不斷地對其進行完善和改進。Stelzl 等[11]在研究中就采用了以下的策略：(1)選擇不同功能、不同大小的蛋白作為誘餌，以確保所選靶蛋白在整個蛋白質組中的代表性；(2)篩選過程中采用兩輪雜交的方法：第一輪以混合誘餌(8 個)對文庫進行篩選，結果呈陽性的克隆再進行一對一的第二輪雜交，這樣既降低了工作量又提高了結果的準確性；(3)pull-down，免疫共沉淀對酵母雙雜交的結果進行體內的相互作用驗證；(4)利用生物信息學的方法對結果進行系統分析，包括基因的染色體定位、蛋白質作用網絡的拓撲結構分析等，從多方面分析結果的可信度。據此，他們最終確認了911 對高可信度的相互作用涉及到401 種蛋白，數據分析中設立了6 個標準來判定得到的結果，大大提高了酵母雙雜交實驗結果的可信度。
2.2 串聯親和純化 Rigaut 等[13]首次采用串聯親和純化技術(tandem affinitpurification，TAP)研究了蛋白間的相互作用，與其他融合標簽方法的最大不同是該方法選用了兩個連續的標簽而不是通常意義上的一個。標簽共分三部分：蛋白A 、C B P (calmodulin binding peptide，鈣調素結合多肽)和中間連接的TEV 酶識別的酶切位點。帶有TAP 標簽的融合蛋白在細胞中表達與內源相互作用蛋白形成復合物，細胞裂解后經IgG 偶聯的層析柱純化，蛋白A 與IgG 特異結合，從而使含有標簽的復合物得到第一次純化。為了除去與柱填料非特異結合的蛋白，用TEV 酶切割分離蛋白A 標簽，使含有靶蛋白的復合物與層析柱分離并經過鈣調素偶聯的親和層析柱進行第二次純化，靶蛋白上的CBP標簽可與鈣調素結合；在加入過量螯合劑EGTA后CBP 與親和層析柱分離使含有靶蛋白的復合體得到分離純化， 經SDS-PAGE，復合物中的各個蛋白被分開，切膠、胰酶消化后，即可通過質譜鑒定復合物中各個蛋白的氨基酸序列(圖1)。該方法的優點：(1)不需要過多的背景知識就可以得到大量含靶蛋白的復合體；(2)蛋白表達及與復合物的結合都接近生理水平，是一種檢測體內蛋白相互作用的方法；(3)TAP 采用兩步親和純化，提高了純化產物的特異性。一般在2L 的酵母培養基中(細胞濕重約10g)可以分離純化得到足夠一維電泳及質譜分析的蛋白復合物[ 1 5 ] 。Gavin 等 [16]采用TAP 結合質譜鑒定，對啤酒酵母的多蛋白復合物進行了大規模的研究。共分析了 1 739 個基因其中與人類基因相關的有1 143 個，純化了589 種蛋白，經生物信息學分析，它們分屬于 232 個不同的多蛋白復合體；在細胞中具有新功能的為344 個，231 個蛋白的功能以前未見報道。由于TAP/MS方法的高靈敏性使得僅有15個拷貝的蛋白也能被檢測到，鑒定的蛋白分子量從6.6kDa 到 559kDa，等電點從3.9 到12.4。這一研究提供了真核生物中二元以上的蛋白相互作用網絡，從中得到的有關其功能的各種信息也能為藥物的篩選提供依據。TAP 技術的出現有效地促進了酵母中大規模的蛋白鑒定和純化工作，但是其在高等真核生物中的應用卻處于滯后狀態，這是因為在真核細胞中表達的內源靶蛋白與帶有標簽的蛋白會發生競爭作用，影響相互作用的研究。因此，Forler 等[17]將RNAi 與TAP 技術聯用在果蠅的S2 細胞(Drosoph ila melanogaster)中研究了蛋白質間的相互作用，該策略避免了內源蛋白的干擾，進而從高等真核細胞中分離并鑒定了相應的蛋白復合體，實驗表明，蛋白純化的特異性及有效性均得到提高，采用這種方法他們還對靶蛋白生物功能進行了分析。iTAP(TAP 與RNAi)保持了TAP 方法在原核生物中應用的一些優勢：(1)基于標簽的親和純化方法；(2)用TAP 標記的蛋白替代內源基因表達產物；但由基因本身的啟動子調控蛋白的表達量，這一點在真核細胞中還無法實現。對于這部分相互作用的研究，人們多采用逆轉錄病毒載體，將帶有標簽的靶蛋白引入細胞中。由于逆轉錄病毒載體能夠穩定的整合在宿主細胞的基因組中并且拷貝量較低，因此，外源蛋白可以近似于生理水平的低表達，進而避免由于高表達而出現的假陽性結果。此外Zhou等[18]在原代細胞中做了有益的嘗試，將TAP標簽通過基因敲入技術引入小鼠中，使得該技術能夠應用于更多的基因并進行組織或細胞類型特異的復合體研究。